感染 Ifnar1 小鼠 Immunoprivileged 器官寨卡病毒特异 T 细胞反应的评价

在寨卡病毒感染期间，T细胞可以渗透到免疫特权器官中，以消除病毒，但也可能导致免疫病变发生，如吉兰-巴雷综合征或睾丸损伤。该技术的主要优点是，它有助于在寨卡病毒感染期间和疫苗免疫后，在免疫特权器官中检测抗原特异性T细胞。在此模型中，寨卡病毒感染在干扰素α/β受体敲除小鼠中启动，允许跟踪大脑、睾丸和脾脏中寨卡病毒特异性T细胞。

使用四联染色方法，可以只调查免疫特权器官渗透寨卡病毒特异性T细胞的特征，以探索T细胞对免疫保护细胞和免疫病理学细胞的贡献。对于寨卡病毒感染，通过逆轨道接种到6至8周大的干扰素α/β受体敲除小鼠中，将10倍的寨卡病毒聚焦单元送到PBS的100微升中。然后，每天监测受感染动物的体重和临床症状15天。

接种后七天，将受感染的动物固定在手术泡沫上的上部位置，并使用无菌手术刀沿着腹部中线进行皮肤切口。用剪刀打开腹部肌肉，轻轻提取肝脏。然后，取出脾脏，并在PBS中冲洗组织三次，以去除血液。

最后一次洗涤后，将脾脏放在1.5毫升的冰冷RPMI介质上，直到收集到所有的脾脏。要产生单细胞悬浮液，将胰蛋白放入无菌的 40 微米网状细胞过滤器中，放在 50 毫升管上，并在过滤器中加入两毫升冰冷的 RPMI 介质，并辅以 10% 胎儿牛血清或 FBS。然后，使用五毫升注射器的柱塞通过过滤器将组织清除，使用新鲜介质通过网格冲洗释放的细胞。

将单细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中进行离心，并在5毫升红细胞解液缓冲液中重新悬浮颗粒。在室温下5至6分钟后，停止用10毫升冰冷RPMI加FBS进行第二次离心的解差，并在10毫升完整介质中重新暂停颗粒进行计数。接种后七天，将一只安乐死、受感染的雄性小鼠固定在切割板上容易的位置，用一比二牙直的钳子固定头皮。

使用虹膜剪刀在头皮上做一个中线切口，露出头骨，并使用锋利的钳子用锋利的钳子夹住轨道的两侧，固定大脑。将一个锋利的虹膜剪刀尖放入前身巨无霸中，横向切成两侧的头骨。小心地从同一腔向上切到中线，朝向鼻子，保持剪刀尖尽可能肤浅，以避免伤害大脑。

用钳子抬起大脑，用锋利的虹膜剪刀仔细解剖颅神经纤维。然后，使用钳子将大脑转移到一个15毫升的管子中，管中含有5毫升的冰冷RPMI加FBS。要隔离睾丸，用钳子抬起腹部皮肤，并使用虹膜剪刀通过切口和腹部壁进行纵向切口，并露出腹部最下部。

将睾丸向上推至切口，并使用钳子轻轻拉脂肪层，露出两侧的球状睾丸。使用虹膜剪刀仔细解剖脂肪层和表皮，将睾丸转移到含有5毫升冰冷RPI加FBS的15毫升管中。要从收获的任一组织产生单细胞悬浮液，请将器官放在无菌细胞过滤器上，在 50 毫升管上用 100 微米网状物，并在过滤器中加入两毫升冰冷的 RPMI 和 FBS。

使用五毫升注射器的柱塞，捣碎组织，用新鲜介质清洗过滤器，直到器官通过网状物完全接地。将单细胞悬浮液转移到15毫升管中进行离心，并在5毫升30%密度梯度介质中重新悬浮颗粒。在新的 15 毫升管中小心地将两毫升 70% 密度梯度介质的细胞溶液分层，然后通过密度梯度离心分离细胞。

然后，将两个密度梯度之间的相位转移至含有 10 毫升冷 RPMI 加 FBS 的新的 15 毫升管，用于另一次离心，然后将颗粒重新在 10 毫升的冰冷 RPMI/FBS 中重新暂停，以进行计数。要通过流式细胞分析细胞，将细胞稀释至FACS缓冲液中每100微升的5倍至6个细胞，并孵育每个样品10微升的抗小鼠CD16/CD32阻断抗体。在室温下10分钟后，根据实验流细胞学染色方案，在96孔圆底板的适当孔中加入20微升细胞，并在暗中室温下将20微升的E-蛋白四分之一米混合物加入到每口井中，在室温下孵育30分钟。

在孵育结束时，将感兴趣的细胞表面抗体添加到细胞中，在4摄氏度下进行30分钟的孵育，不受光线影响。接下来，每次洗涤用200微升的FACS缓冲液清洗两次细胞，并小心地用200微升的新鲜FACS缓冲液重新填充每井中的细胞。然后，将样品储存在四摄氏度，防止光线，直到他们分析流动细胞仪。

在寨卡病毒接种7天后，在干扰素α/β受体1敲除小鼠中观察到病理症状和体征，如血毒症和运动性对等。被感染干扰素α/β受体1的体重增加变化监测15天，在感染后4天首次观察到体重减轻，从感染后的第7天开始体重恢复。感染的穆林大脑的代表性图像显示明显的水肿和高血症在接种寨卡病毒后七天。

被感染的穆林寨卡感染睾丸的代表性图像显示，感染后的第7天逐渐缩小至30天。对寨卡感染的大脑和睾丸组织部分进行组织病理学分析也说明了与未感染的对联控制相比，破坏性病理变化的影响。正如宏观和组织病理学分析所预料的，通过免疫控制在寨卡病毒感染小鼠的大脑和睾丸中也检测到高病毒载量。

这伴随着一个强大的CD3阳性T细胞渗透到寨卡感染后的大脑。寨卡病毒特异性CD3阳性，CD8阳性T淋巴细胞通过E-protein四分体染色在寨卡病毒感染和疫苗免疫小鼠中检测。电子蛋白四分之一特异性CD8阳性T细胞也可以在大脑中检测到，并在接种寨卡病毒后7天进行检测。

该技术开发后，为研究人员在动物模型中自然感染免疫活细胞中病原体特异性T细胞表征的研究铺平了道路。此方法也适用于其他免疫功能，如胎盘或眼睛，以及病毒感染和癌症。按照这个程序，MHC-I三角体可用于病原体特异性T细胞的免疫组织化学或免疫荧光检测，以访问大脑或睾丸渗透T细胞的分布。