Während einer Zika-Virusinfektion können T-Zellen immunprivilegierte Organe zur Viruseliminierung infiltrieren, aber auch zur Immunpathogenese beitragen, wie das Guillain-Barre-Syndrom oder Hodenverletzungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Tetramer-basierten Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen in immunprivilegierten Organen sowohl während der Zika-Virusinfektion als auch nach der Immunimpfung erleichtert. In diesem Modell wird eine Zika-Virusinfektion bei Interferon-Alpha/Beta-Rezeptor-Knockout-Mäusen initiiert, was die Verfolgung von Zika-virusspezifischen T-Zellen im Gehirn, Hoden und Milz ermöglicht.
Mit Hilfe eines Tetramer-Färbeansatzes ist es möglich, nur Merkmale von immunprivilegierten Organen zu untersuchen, die Zika-virusspezifische T-Zellen infiltrieren, um T-Zell-Beiträge zu immunschutzfreien und immunpathogenen Zellen zu erforschen. Für eine Zika-Virusinfektion, liefern Sie ein mal 10 an die vier fokusbildenden Einheiten des Zika-Virus in 100 Mikroliter PBS über retro-orbitale Impfung in sechs bis acht Wochen alte Interferon Alpha/Beta-Rezeptor-Knockout-Mäuse. Überwachen Sie dann das Gewicht und die klinischen Symptome der infizierten Tiere täglich für 15 Tage.
Sieben Tage nach der Impfung, sichern Sie das infizierte Tier in der Supine-Position auf einem chirurgischen Schaum, und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen Hautschnitt entlang der Mittellinie des Bauches zu machen. Verwenden Sie eine Schere, um die Bauchmuskeln zu öffnen, und extrahieren Sie sanft die Leber. Dann entfernen Sie die Milz, und spülen Sie das Gewebe dreimal in PBS, um das Blut zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche die Milz auf 1,5 Milliliter eiskaltes RPMI-Medium auf Eis legen, bis alle Milz gesammelt sind. Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, legen Sie die Milz in ein steriles, 40-Mikrometer-Netzzellensieb auf einer 50-Milliliter-Röhre und fügen Sie dem Sieb zwei Milliliter eiskaltes RPMI-Medium hinzu, das mit 10% fetalem Rinderserum oder FBS ergänzt wird. Verwenden Sie dann den Kolben einer Fünf-Milliliter-Spritze, um das Gewebe durch den Filter zu mazerieren, indem Sie frisches Medium verwenden, um die freigesetzten Zellen durch das Netz zu spülen.
Übertragen Sie die einzellige Suspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Konikonröhre und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern roter Blutzelllysepuffer wieder auf. Nach fünf bis sechs Minuten bei Raumtemperatur die Lyse mit 10 Millilitern eiskaltem RPMI plus FBS für eine zweite Zentrifugation stoppen und das Pellet in 10 Milliliter neines kompletten Mediums zum Zählen wieder aufhängen. Sieben Tage nach der Impfung, immobilisieren Sie eine eingeschläferte, infizierte, männliche Maus in der anfälligen Position auf einem Schneidebrett, und sichern Sie die Kopfhaut mit geraden einmal zwei Zähne Zangen.
Verwenden Sie Irisschere, um einen Mittellinienschnitt auf der Kopfhaut zu machen, den Schädel freizulegen, und verwenden Sie scharfe Pinzette, um die beiden Seiten der Bahnen mit einer scharfen Pinzette zu klemmen und das Gehirn zu fixieren. Legen Sie eine Spitze der scharfen Irisschere in das Foramen Magnum, seitlich in den Schädel auf jeder Seite geschnitten. Sorgfältig aus dem gleichen Hohlraum bis zur Mittellinie schneiden, in Richtung der Nase, halten die Scherenspitzen so oberflächlich wie möglich, um zu vermeiden, das Gehirn zu verletzen.
Heben Sie das Gehirn mit Zange, und verwenden Scharfe IrisSchere, um sorgfältig die Schädelnervenfasern zu sezieren. Dann verwenden Sie die Zange, um das Gehirn in eine 15-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitereis-KÄLTE RPMI plus FBS zu übertragen. Um die Hoden zu isolieren, heben Sie die Bauchhaut mit Zange, und verwenden Sie die Irisschere, um einen Längsschnitt durch die Integument- und Bauchwand zu machen und den untersten Teil des Bauches freizulegen.
Schieben Sie die Hoden bis zum Schnitt, und verwenden Sie eine Pinzette, um die Fettschicht sanft zu ziehen, um einen kugelförmigen Hoden auf beiden Seiten freizulegen. Verwenden Sie die Irisschere, um die Fettschicht und epididymis sorgfältig zu sezieren, und übertragen Sie die Hoden in eine 15-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitereiskaltem RPMI plus FBS. Um eine einzellige Suspension aus einem der geernteten Gewebe zu erzeugen, legen Sie das Organ auf ein steriles Zellsieb mit einem 100-Mikrometer-Netz auf einem 50-Milliliter-Rohr und fügen Sie dem Sieb zwei Milliliter eiskaltes RPMI plus FBS hinzu.
Mit dem Kolben aus einer Fünf-Milliliter-Spritze, zerkleinern Sie das Gewebe, und waschen Sie den Filter mit frischem Medium, bis das Organ vollständig durch das Netz geschliffen wurde. Übertragen Sie die einzellige Suspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr, und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern mit 30%DichteGradientenmedium wieder auf. Schichtung der Zelllösung vorsichtig über zwei Milliliter mit 70%Dichte Gradientenmedium in einem neuen 15-Milliliter-Rohr und trennen die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation.
Übertragen Sie dann die Zellen aus der Interphase zwischen den beiden Dichtegradienten auf ein neues 15-Milliliter-Rohr mit 10 Milliliter kaltem RPMI plus FBS für eine weitere Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter eiskaltem RPMI/FBS zum Zählen wieder auf. Um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, verdünnen Sie die Zellen auf fünfmal 10 bis sechs Zellen pro 100 Mikroliter in FACS-Pufferkonzentration, und inkubieren Sie die Zellproben mit 10 Mikrolitern Anti-Maus-CD16/CD32 blockierendem Antikörper pro Probe. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur 20 Mikroliter Zellen in die entsprechende Anzahl von Brunnen einer 96-Well-, Rundbodenplatte gemäß dem experimentellen Flusszytometrie-Färbeprotokoll geben und 20 Mikroliter des E-Protein-Tetramet-Mixes zu jedem Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzufügen.
Am Ende der Inkubation fügen Sie den Zellen die von Interesse sindden Zelloberflächenantikörper für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu, die vor Licht geschützt ist. Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikroliter FACS-Puffer pro Waschgang und setzen Die Zellen in jedem Brunnen vorsichtig mit 200 Mikrolitern frischen FACS-Puffer san. Dann lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht, bis zu ihrer Analyse auf einem Durchflusszytometer.
Pathologische Symptome und Anzeichen wie Myeloparalyse und motorische Paraparese werden bei Interferon-Alpha/Beta-Rezeptor 1 Knockout-Mäusen sieben Tage nach der Impfung mit dem Zika-Virus beobachtet. Gewichtsänderungen im infizierten Interferon alpha/Beta-Rezeptor 1 Knockout-Tiere wurden für 15 Tage überwacht, mit Gewichtsverlust zuerst beobachtet vier Tage nach der Infektion und Gewichtserholung ab Tag sieben nach der Infektion. Repräsentative Bilder von infizierten murinen Gehirnen zeigen offensichtliche Ödeme und Hyperämie sieben Tage nach der Inokulation mit dem Zika-Virus.
Repräsentative Bilder von murinen Zika-infizierten Hoden zeigen eine allmähliche Schrumpfung vom siebten auf 30 Tage nach der Infektion. Die histopathologische Analyse von Zika-infizierten Hirn- und Hodengewebeabschnitten veranschaulicht auch die Wirkung der destruktiven pathologischen Veränderungen im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen. Wie aus den makro- und histopathologischen Analysen erwartet, werden hohe Virusbelastungen auch im Gehirn und im Hoden von Zika-Virus-infizierten Mäusen durch Immunfärbung nachgewiesen.
Das geht einher mit einer robusten CD3-positiven T-Zell-Infiltration in das Gehirn nach der Zika-Infektion. Zika-virusspezifische CD3-positive, CD8-positive T-Lymphozyten werden sowohl bei Zika-Virus-infizierten als auch bei immunimmunisierten Mäusen durch E-Protein-Tetramerfärbung nachgewiesen. E-Protein-Tetramer-spezifische CD8-positive T-Zellen können auch im Gehirn nachgewiesen werden und Testen sieben Tage nach der Impfung mit Dem Zika-Virus.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern den Weg bei der Untersuchung der pathogen-spezifischen T-Zell-Charakterisierung in immunvorherrschenden Organen bei natürlichen Infektionen in Tiermodellen. Diese Methode kann auch auf andere immun verbreitete Organe angewendet werden, wie Plazenta oder Auge, sowie auf Virusinfektionen und Krebs. Nach diesem Verfahren können MHC-I-Tetramere für den immunhistochemischen oder immunfluoreszierenden Nachweis pathogenspezifischer T-Zellen verwendet werden, um zugang zur Verteilung von Hirn- oder Hoden-infiltrierenden T-Zellen zu erhalten.
