HUVEC 管形成测定评估天然产物对血管生成的影响

管形成分析是一种体外测试，用于研究导致形成新血管的几个步骤的分子机制。这种测定允许识别与血管生成相关的化合物和信号级联。通过一个测试，我们能够证明像RGWE这样的天然化合物会降低内皮细胞形成管状结构的能力，不会影响细胞的生存能力，而且这种效果取决于 MEK/ERK 通路的激活。使用正确的单元格数执行测试非常重要。事实上，太少或太多的细胞不能允许正确的形成管。因此，建议进行初步测试，以找出正确的细胞数。卢卡·奥尔加·帕斯托里诺，我实验室的博士生，将展示程序。首先，在春季和夏季收集鲁塔墓碑叶。将250克切碎的叶子放入圆锥形烧瓶中，加入一升蒸馏水、煮沸和过滤，如手稿中所述。第二天，使用冻干剂对叶提取物进行冻干。获得粉末后，称重，并将其分成等分。根据文本协议，在内皮细胞生长介质中培养HUVEC。当细胞达到80%的汇合时，以一比三的比例通过细胞。使用第二通道和第五通道之间获得的细胞。一旦通过的HUVECs达到70%的汇合，用含有感兴趣的基因的载体的一微克将其转接。 将一微克DNA与稀释的利波卡明2000的三微升混合。然后，从HUVECs中去除该介质，用一毫升新鲜完整介质代替。将转式溶液加入细胞中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞。转经3小时后，加入7毫升新鲜完整介质，再孵育细胞24至48小时。在地下室准备之前，在冰上放一个预冷却的96井板，并在每一个井中加入50微升的冷基质。当板孵育时，用一毫升的PBS/EDTA溶液清洗HUVEC。然后，向细胞中加入一毫升的 Trypsin-EDTA 溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。然后，将细胞重新在一毫升PBS中重新发送。将 0.2 毫升的细胞悬浮液转移到 0.5 毫升的 PBS 中，并使用 trypan 蓝色溶液。在室温下保持悬浮液五分钟后，在 B 中计算细胞数