过去，豚鼠模型中免疫治疗的特征仅限于测量体液免疫。ELISpot测定克服了这一限制，它将有助于研究人员在动物模型中生成更有意义的数据。这种技术的主要优点是细胞是从外周血获得的。
无需尸检。这不仅允许测量量级，而且允许测量在自然感染期间或整个疫苗方案中个体豚鼠的T细胞反应动力学。演示程序将是霍莉 · 普格。
她是伊诺维奥临床前研发部的副研究员。开始向 ELISpot 测定板的每个井中加入 15 微升 35% 乙醇。60 秒后，每井添加 150 微升 PBS。
并反转板，停止乙醇预处理。在操作 ELISpot 检测板时，还应小心谨慎，以避免污染或损坏膜。要清洗板，每井添加 250 微升 PBS。
再重复洗涤两次后，在每孔中加入100微升捕获抗吉奇猪干扰素伽马抗体E4。然后在4摄氏度下孵育板至少12小时。孵育期后洗盘子三次。
向每井添加 200 微升阻塞缓冲器。在室温下孵育板两小时。然后再洗三次盘子。
准备具有 4.5 ml 室温密度梯度介质的锥形管。然后混合同等体积的汉克斯平衡盐溶液与血液。稀释的血液逐渐覆盖密度梯度介质，注意不要干扰界面。
在此之后，在室温下以 800 x g 离心管 30 分钟，无需刹车。从离心机上拆下管子，注意不要打扰层。正确识别图层后，将吸气覆盖完整的布衣层以收获 PBMC。
在密度梯度介质上缓慢地将HBSS稀释的血液分层。避免管的任何干扰，并关闭离心机制动器。将细胞转移到新的15ml管。
然后稀释R10中基中的细胞，总体积为15毫升。颗粒化细胞后，丢弃上经剂，并在15ml的R10介质中重新暂停细胞。通过70微米细胞过滤器将细胞悬浮液进入新管中。
使用 Trypan 蓝色排除测试计算细胞数并确定活细胞的数量。然后用R10介质稀释细胞。首先拆下阻塞缓冲液并清洗板。
对于每个 PBMC 样本，指示阳性控制、负对和每个实验特异性兴奋剂的三联。将R10中位蛋白质肽池稀释至所需最终浓度的三倍。在此之后，在板的兴奋剂检测井中加入50微升的肽R10中混合物。
然后在R10介质中加入50微升的MT肽配方，加入到板的负控制井中。在 R10 介质中加入 ConA 到板的正控井中，然后在所有孔中加入 100 微升的 PBMC 悬浮液。将 ELISpot 板放在培养箱中的均匀表面上，避免在孵化期间干扰板。
小心地从培养箱中取出盘子后，反转板以取出上经剂。然后洗盘子三次。在每个井中加入100微升稀释生物基化检测捕获抗几内亚猪干扰素伽马抗体N-G3。
然后在室温下孵育板两小时。反转板以去除抗体溶液，并重复洗涤三次。从板中去除 PBS 后，将 100 微升的 ALP 联结链丁稀释到每孔的缓冲液中。
然后在室温下孵育板一小时。反转板以丢弃 ALP 链球菌溶液，然后清洗板两次。倒置盘子，将其印在干净的纸巾上，以去除多余的 PBS。
在此之后，用每井250微升的超纯DI水清洗板。倒置盘子，用干净的纸巾取出多余的水。接下来，在每一个井中加入100微升的BCIP/NBT基板溶液。
在室温下孵育板20分钟，防止光线。用DI水冲洗盘子四次。然后反转并轻拍板以去除多余的水。
最后，从板底取出塑料排水管，让膜完全干燥。成功密度梯度离心后，如先前所证明的，管底的红色粘性液体应包含大部分红血球。薄涂层层位于等离子体层和密度梯度介质之间。
在添加捕获抗体之前对油井进行预处理，测定显示改进的定义，同时减少负控制井中非特异性斑点的数量。斑点表明干扰素伽马在PBMC种群中产生T细胞。在尝试这种技术时，重要的是要记住小心但快速处理血液。
这将提高细胞的生存能力，改善斑点的形成，减少非特异性斑点的形成。不要忘记，使用血液和 BCIP/NBT 基材可能很危险，在执行本程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的 PPE。我相信，该协议允许研究人员研究具有结核病、埃博拉和HSV等重要T细胞成分的疾病。
重要的是，它将改进豚鼠模型疫苗协议的开发，并减少使用不太相关的动物模型。
