في الماضي كان توصيف العلاج المناعي في نموذج خنزير غينيا يقتصر على قياس مناعة الخلط. ويتغلب مقايسة ELISpot على هذا القيد وسوف يساعد الباحثين على توليد بيانات أكثر جدوى في هذا النموذج الحيواني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يتم الحصول على الخلايا من الدم المحيطي.
لا يلزم تشريح. وهذا يسمح بقياس ليس فقط حجم ولكن أيضا حركية استجابات الخلايا التائية في خنازير غينيا الفردية خلال عدوى طبيعية أو في جميع أنحاء نظام لقاح. إثبات الإجراء سيكون (هولي بو)
إنها باحثة مشاركة من قسم (إنفويو) قبل الـ(آر) و (د) للبدء في إضافة 15 ميكرولترات من 35٪ الإيثانول إلى كل بئر من لوحة فحص ELISpot. بعد 60 ثانية إضافة 150 microliters من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
وعكس لوحة لوقف المعالجة المسبقة الإيثانول. وينبغي أيضا أن تمارس عناية كبيرة عند التعامل مع لوحات مُقايسة ELISpot لتجنب التلوث أو إتلاف الغشاء. لغسل لوحة إضافة 250 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
بعد تكرار غسل مرتين أكثر، إضافة 100 ميكرولترات من التقاط المضادة لغينيا خنزير انترفيرون الأجسام المضادة للأشعة والأشعة الغاما VE4 لكل بئر. ثم احتضان لوحة لمدة 12 ساعة على الأقل في 4 درجات مئوية. بعد فترة الحضانة تغسل لوحات ثلاث مرات.
إضافة 200 ميكرولتررس من العازلة حظر إلى كل بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثم غسل لوحات ثلاث مرات أخرى.
إعداد أنابيب مخروطية مع 4.5 مل من درجة حرارة الغرفة متوسطة الكثافة الانحدار. ثم اخلطي حجمًا متساويًا من حل الملح المتوازن Hanks مع الدم. طبقة الدم المخفف تدريجيا على متوسطة التدرج الكثافة، مع الحرص على عدم إزعاج واجهة.
بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 800 × ز لمدة 30 دقيقة دون الفرامل في درجة حرارة الغرفة. إزالة أنبوب من جهاز الطرد المركزي، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقات. بعد تحديد بشكل صحيح طبقات التعرق طبقة معطف بافي كاملة لحصاد PBMCs.
طبقة ببطء الدم HBSS المخفف على متوسطة الانحدار الكثافة. تجنب أي اضطراب في الأنبوب وإيقاف فرامل أجهزة الطرد المركزي. نقل الخلايا إلى أنبوب جديد 15 مل.
ثم تخفيف الخلايا في R10 متوسطة إلى حجم إجمالي قدره 15 مل. بعد تربيب الخلايا، والتخلص من افرا و resuspend الخلايا في 15 مل من R10 المتوسطة. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب جديد.
عد الخلايا وحدد عدد الخلايا الحية مع اختبار استبعاد Trypan الأزرق. ثم تمييع الخلايا مع R10 المتوسطة. أولاً إزالة العازلة حظر وغسل لوحات.
لكل عينة PBMC تشير إلى ثلاثية من التحكم الإيجابي، التحكم السلبي، وكل منبه التجربة الخاصة. تخفيف البروتين الببتيد في R10 متوسطة إلى ثلاثة أضعاف التركيز النهائي المطلوب. بعد هذا إضافة 50 ميكرولترات من الخليط المتوسط من الببتيد R10 إلى آبار اختبار المنشطات من لوحة.
ثم إضافة 50 ميكرولتردات من صياغة الببتيد طن متري في R10 المتوسطة إلى آبار التحكم السلبية من لوحة. أضف ConA في R10 متوسطة إلى آبار التحكم الإيجابية في اللوحة ، ثم أضف 100 ميكرولترات من تعليق PBMC إلى جميع الآبار. ضع لوحة ELISpot على سطح زوجي في الحاضنة وتجنب إزعاج اللوحة خلال فترة الحضانة.
بعد إزالة لوحة بعناية من الحاضنة، عكس لوحة لإزالة ناظر. ثم غسل لوحة ثلاث مرات. إضافة 100 ميكرولترات من الكشف المخفف biotinylated التقاط المضادة لغينيا خنزير إنترفيرون غاما الأجسام المضادة N-G3 إلى كل بئر.
ثم احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. عكس لوحة لإزالة حل الأجسام المضادة وتكرار غسل ثلاث مرات. بعد إزالة برنامج تلفزيوني من لوحة، إضافة 100 ميكرولترات من ALP مترافق streptavidin المخفف في عازلة سد إلى كل بئر.
ثم احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. عكس لوحة لتجاهل محلول ALP streptavidin وغسل لوحة مرتين. عكس لوحة ولطخة ضد منشفة ورقية نظيفة لإزالة أي برنامج تلفزيوني الزائدة.
بعد هذا يغسل لوحة مع 250 ميكرولترات من المياه دي Ultrapure في البئر. عكس لوحة وإزالة المياه الزائدة مع منشفة ورقية نظيفة. أضف التالي 100 ميكرولترات من BCIP / NBT حل الركيزة لكل بئر.
احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. شطف لوحة أربع مرات مع المياه DI. ثم عكس والاستفادة من لوحة لإزالة المياه الزائدة.
وأخيرا، إزالة الصرف البلاستيكي من الجزء السفلي من لوحة والسماح للغشاء لتجف تماما. بعد نجاح الطاردة الانحدارية كثافة كما ثبت سابقا، السائل اللزج الأحمر في الجزء السفلي من الأنبوب يجب أن تحتوي على معظم خلايا الدم الحمراء. طبقة معطف بافي بين طبقة من البلازما والكثافة الانحدار المتوسطة.
قبل الآبار قبل إضافة الأجسام المضادة التقاط، عرض تحليل أفضل تعريف جنبا إلى جنب مع انخفاض في عدد من البقع غير محددة في آبار التحكم السلبية. تشير البقع إلى أن إنترفيرون غاما ينتج خلايا تائية داخل مجموعة PBMC. عند محاولة هذه التقنية، من المهم أن نتذكر أن معالجة بعناية ولكن بسرعة الدم.
وهذا من شأنه أن يحسن من صلاحية الخلية، وتحسين تشكيل البقعة، والحد من تشكيل البقع غير محددة. لا تنس أن العمل مع الدم و تحتية BCIP/NBT يمكن أن تكون خطرة وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة دائماً أثناء تنفيذ هذا الإجراء. وأعتقد أن هذا البروتوكول يسمح للباحثين بدراسة الأمراض التي تحتوي على مكون هام من الخلايا التفاًلية مثل السل والإيبولا وHSV.
والأهم من ذلك، أنه سيصقل وضع بروتوكولات اللقاحات في نموذج خنزير غينيا وسيقلل من استخدام النماذج الحيوانية الأقل أهمية.
