Dans le passé, la caractérisation de l’immunothérapie dans le modèle de cobaye se limitait à mesurer l’immunité humoristique. L’analyse ELISpot surmonte cette limitation et aidera les chercheurs à générer des données plus significatives dans ce modèle animal. Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont obtenues à partir de sang périphérique.
Aucune autopsie n’est requise. Cela permet de mesurer non seulement l’ampleur, mais aussi la cinétique des réponses des cellules T chez les cobayes individuels lors d’une infection naturelle ou tout au long d’un régime vaccinal. La démonstration de la procédure sera Holly Pugh.
Et inverser la plaque pour arrêter le prétraitement de l’éthanol. Un grand soin doit également être exercé lors de la manipulation des plaques d’analyse ELISpot pour éviter la contamination ou endommager la membrane. Pour laver la plaque ajouter 250 microlitres de PBS à chaque puits.
Après avoir répété le lavage deux fois de plus, ajouter 100 microlitres de capture anti-cochon d’Inde anticorps gamma VE4 à chaque puits. Puis incuber la plaque pendant au moins 12 heures à 4 degrés Celsius. Après la période d’incubation, laver les assiettes trois fois.
Ajouter 200 microlitres de tampon de blocage à chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, lavez les assiettes trois fois de plus.
Préparer les tubes coniques avec 4,5 ml de gradient de densité de température ambiante moyen. Mélangez ensuite un volume égal de solution de sel équilibré hanks avec le sang. Superposer progressivement le sang dilué sur le milieu de gradient de densité, en prenant soin de ne pas perturber l’interface.
Après cela, centrifuger les tubes à 800 x g pendant 30 minutes sans freins à température ambiante. Retirer le tube de la centrifugeuse, en prenant soin de ne pas déranger les couches. Après avoir correctement identifié les couches aspirer la couche de pelage buffy complète pour récolter les PBMCs.
Superposez lentement le sang dilué HBSS sur le milieu de gradient de densité. Évitez toute perturbation du tube et éteignez les freins centrifugeuses. Transférer les cellules dans un nouveau tube de 15 ml.
Ensuite, diluer les cellules en R10 moyen à un volume total de 15 ml. Après avoir granulé les cellules, jeter le supernatant et résuspendre les cellules dans 15 ml de R10 moyen. Passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un nouveau tube.
Comptez les cellules et déterminez le nombre de cellules vivantes avec le test d’exclusion bleu Trypan. Ensuite, diluer les cellules avec R10 moyen. Retirez d’abord le tampon de blocage et lavez les assiettes.
Pour chaque échantillon PBMC indiquent les triplicates du contrôle positif, le contrôle négatif, et chaque stimulant spécifique à l’expérience. Diluer le bassin de peptides protéiques en R10 moyen à trois fois la concentration finale désirée. Après cela ajouter 50 microlitres du mélange moyen peptidique R10 aux puits d’essai stimulants de la plaque.
Ajouter ensuite 50 microlitres de formulation de peptide MT dans le milieu R10 aux puits de contrôle négatifs de la plaque. Ajouter conA dans R10 moyen aux puits de contrôle positifs de la plaque, puis ajouter 100 microlitres de la suspension PBMC à tous les puits. Placez la plaque ELISpot sur une surface même dans l’incubateur et évitez de déranger la plaque pendant la période d’incubation.
Après avoir soigneusement retiré la plaque de l’incubateur, inverser la plaque pour enlever le surnatant. Ensuite, lavez la plaque trois fois. Ajouter 100 microlitres de détection biotinylée diluée capturer anti-cobaye interféron gamma anticorps N-G3 à chaque puits.
Ensuite, incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures. Inverser la plaque pour enlever la solution anticorps et répéter le lavage trois fois. Après avoir retiré le PBS de la plaque, ajouter 100 microlitres de streptavidine conjuguée ALP dilués dans le tampon de blocage à chaque puits.
Ensuite, incuber la plaque à température ambiante pendant une heure. Inverser la plaque pour jeter la solution streptavidine ALP et laver la plaque deux fois. Inversez la plaque et épongez-la contre une serviette en papier propre pour enlever tout excès de PBS.
Après cela laver la plaque avec 250 microlitres d’eau Ultrapure DI par puits. Inverser la plaque et retirer l’excès d’eau avec une serviette en papier propre. Ajouter ensuite 100 microlitres de solution de substrat BCIP/NBT à chaque puits.
Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes à l’abri de la lumière. Rincer la plaque quatre fois à l’eau DI. Puis inverser et appuyez sur la plaque pour enlever l’excès d’eau.
Enfin, retirez le drainage plastique du fond de la plaque et laissez la membrane sécher complètement. Après centrifugation réussie de gradient de densité comme précédemment démontré, le liquide visqueux rouge au fond du tube devrait contenir la plupart des globules rouges. La couche de pelage chamois se situe entre la couche de plasma et le milieu de gradient de densité.
Prétraitant les puits avant d’ajouter l’anticorps de capture, l’essai a montré une définition améliorée avec une réduction du nombre de taches non spécifiques dans les puits de contrôle négatifs. Les taches sont indicatives de l’interféron gamma produisant des cellules T au sein de la population de PBMC. Lorsque vous essayez cette technique, il est important de se rappeler de traiter soigneusement mais rapidement le sang.
Cela améliorera la viabilité cellulaire, améliorera la formation ponctuelle et réduira la formation de taches non spécifiques. N’oubliez pas que le travail avec le sang et le substrat BCIP/NBT peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Je crois que ce protocole permet aux chercheurs d’étudier les maladies avec une composante importante des cellules T comme la tuberculose, Ebola et le VHS.
Fait important, il affinera le développement de protocoles vaccinaux dans le modèle des cobayes et réduira l’utilisation de modèles animaux moins pertinents.
