In der Vergangenheit beschränkte sich die Charakterisierung von Immuntherapeutika im Meerschweinchenmodell auf die Messung der humoralen Immunität. Der ELISpot-Assay überwindet diese Einschränkung und wird Forschern helfen, aussagekräftigere Daten in diesem Tiermodell zu generieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Zellen aus peripherem Blut gewonnen werden.
Es ist keine Nekropsie erforderlich. Dies ermöglicht nicht nur die Messung der Größe, sondern auch die Kinetik der T-Zell-Antworten bei einzelnen Meerschweinchen während einer natürlichen Infektion oder während eines Impfstoffschemas. Demonstrieren sie das Verfahren wird Holly Pugh sein.
Sie ist wissenschaftliche Mitarbeiterin der präklinischen R- und D-Abteilung von Inovio. Beginnen Sie 15 Mikroliter 35% Ethanol zu jedem Brunnen einer ELISpot-Assayplatte. Nach 60 Sekunden 150 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzufügen.
Und die Platte invertieren, um die Ethanol-Vorbehandlung zu stoppen. Große Sorgfalt sollte auch beim Umgang mit den ELISpot-Assayplatten geübt werden, um eine Kontamination oder Beschädigung der Membran zu vermeiden. Um die Platte zu waschen fügen Sie 250 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen.
Nachdem Sie die Wäsche zwei weitere Male wiederholt haben, fügen Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter Anti-Meerschweinchen-Interferon-Gamma-Antikörper VE4 hinzu. Dann inkubieren Sie die Platte für mindestens 12 Stunden bei 4 Grad Celsius. Nach der Inkubationszeit die Teller dreimal waschen.
Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Dann waschen Sie die Teller noch dreimal.
Bereiten Sie konische Rohre mit 4,5 ml Raumtemperatur-Gradientenmedium vor. Dann mischen Sie ein gleiches Volumen von Hanks'Balanced Salt Solution mit dem Blut. Schichtdas verdünntes Blut nach und nach über die Dichte Gradient medium, achten darauf, nicht die Schnittstelle zu stören.
Danach zentrieren Sie die Rohre bei 800 x g 30 Minuten lang ohne Bremsen bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Rohr aus der Zentrifuge, wobei darauf geachtet wird, die Schichten nicht zu stören. Nach korrekter Identifizierung der Schichten saugen Die komplette Buffy-Schicht an, um die PBMCs zu ernten.
Schichtung des HBSS-verdünnten Blutes langsam auf das Dichtegradientenmedium. Vermeiden Sie Störungen des Rohres und schalten Sie die Zentrifugenbremsen aus. Übertragen Sie die Zellen in eine neue 15 ml Tube.
Dann verdünnen Sie die Zellen in R10 mittel bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml. Nach dem Pelletieren der Zellen, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 15 ml R10 Medium. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues Rohr.
Zählen Sie die Zellen und bestimmen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit dem Trypan-Blauausschlusstest. Dann verdünnen Sie die Zellen mit R10 medium. Entfernen Sie zunächst den Sperrpuffer und waschen Sie die Platten.
Für jede PBMC-Probe geben Triplicate der Positivkontrolle, der Negativkontrolle und jedes experimentierfreudige Stimulans an. Verdünnen Sie den Proteinpeptidpool in R10 mittel- bis dreimal so hoch wie die gewünschte Endkonzentration. Danach 50 Mikroliter des Peptids R10 Medium Mischung zu den Stimulans Testbrunnen der Platte hinzufügen.
Dann fügen Sie 50 Mikroliter MT Peptid Formulierung in R10 medium zu den negativen Kontrollbrunnen der Platte. Fügen Sie ConA in R10 Medium zu den Positivkontrollbrunnen der Platte hinzu, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der PBMC-Suspension in alle Brunnen ein. Legen Sie die ELISpot-Platte auf eine gleichmäßige Oberfläche im Inkubator und vermeiden Sie es, die Platte während der Inkubationszeit zu stören.
Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Inkubator entfernt haben, kehren Sie die Platte um, um den Überstand zu entfernen. Dann waschen Sie den Teller dreimal. Fügen Sie 100 Mikroliter verdünnter biotinylierter Detektion simpere Anti-Meerschweinchen-Interferon-Gamma-Antikörper N-G3 zu jedem Brunnen.
Dann inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Invertieren Sie die Platte, um die Antikörperlösung zu entfernen und die Wäsche dreimal zu wiederholen. Nach dem Entfernen der PBS von der Platte, fügen Sie 100 Mikroliter ALP konjugierte sedierte sptavidin in Sperrpuffer verdünnt zu jedem Brunnen.
Dann inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde. Invertieren Sie die Platte, um die ALP Streptavidin Lösung zu entsorgen und waschen Sie die Platte zweimal. Invertieren Sie die Platte und blots es gegen ein sauberes Papiertuch, um überschüssige PBS zu entfernen.
Danach die Platte mit 250 Mikroliter Neines DI-Wasser pro Brunnen waschen. Invertieren Sie die Platte und entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem sauberen Papiertuch. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter BCIP/NBT Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu.
Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten vor Licht geschützt. Spülen Sie die Platte viermal mit DI-Wasser. Dann invertieren und tippen Sie auf die Platte, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
Schließlich entfernen Sie die Kunststoffentwässerung von der Unterseite der Platte und lassen Sie die Membran vollständig trocknen. Nach erfolgreicher Dichtegradientenzentrifugation, wie bereits gezeigt, sollte die rote viskose Flüssigkeit am Boden des Rohres die meisten roten Blutkörperchen enthalten. Die buffy Schicht liegt zwischen der Plasmaschicht und dem Dichtegradientenmedium.
Die Vorbehandlung der Brunnen vor dem Hinzufügen des Capture-Antikörpers zeigte der Assay eine verbesserte Definition zusammen mit einer Verringerung der Anzahl unspezifischer Flecken in den negativkontrollierbaren Brunnen. Spots deuten auf Interferon-Gamma-Produzierenvon T-Zellen innerhalb der PBMC-Population hin. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, sich daran zu erinnern, das Blut sorgfältig, aber schnell zu verarbeiten.
Dies wird die Zelllebensfähigkeit verbessern, die Punktbildung verbessern und die Bildung unspezifischer Flecken reduzieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut und BCIP/NBT-Substrat gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden. Ich glaube, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglicht, Krankheiten mit einer wichtigen T-Zell-Komponente wie TB, Ebola und HSV zu untersuchen.
Wichtig ist, dass die Entwicklung von Impfstoffprotokollen im Versuchskaninchenmodell verfeinert und der Einsatz weniger relevanter Tiermodelle verringert wird.
