监测小鼠睡眠/觉醒状态期间神经回路的光遗传学操作

此过程可以帮助我们识别特定神经回路的功能，这些神经回路涉及睡眠觉醒调节，具有较少的侵入性操作和高时间分辨率。这种方法允许我们实时监测表面EEG，并结合特定神经电路的操作来检查电路与睡眠觉醒状态之间的因果关系。肖塔·科达尼将演示这个程序。

在确认对脚趾捏没有反应后，在动物的眼睛上涂抹软膏，并使用耳条和鼻针到立体定向器械上，将麻醉小鼠的头部稳定在吸水垫上。当头部固定在位置时，在头皮上做一个中下垂切口，以确认苏图拉萨吉塔利和苏图拉冠状冠或苏图拉羊皮多伊达之间的交点在同一水平水平线。为避免定位间隙，请根据需要调整鼻夹和耳杆。

然后使用塞拉芬夹保持皮肤打开消毒头骨的暴露表面，使颅缝合线可视化更清晰。注射腺相关病毒载体，将乙醇消毒的10毫升注射器与两微升的矿物油，然后注入病毒的实验量。使用微注射泵将微注射针的尖端调整到呼吸管上，并注意坐标作为原点。

然后将尖端移动到指定的注射部位，然后将针头尖放在该位置上。在注射部位标记头骨，并使用装有 0.7 毫米硬质合金切割机的牙科钻头在头骨上钻一个直径约 2 毫米的孔。用棉签从孔周围去除血液后，缓慢地将针头移动到刺孔或BSNT的床核，并缓慢注射指定体积的病毒溶液。

然后将针头留在位上五分钟，使溶液充分渗入 BNST 组织，然后小心地缩回针头。对于脑电图（或 EEG）和脑电图（EMG）、电极植入，首先焊接两根不锈钢线，从两端剥离一毫米绝缘层到 EMG 电极，然后将电极的中心放在脑膜上。然后标记每个 EEG 电极的位置。

要确定光纤植入物的位置，请将光纤铁杉连接到操纵器，然后将操纵器臂旋转到横 30 度角。将光纤尖端放在啤酒上并记录坐标。将尖端移动到目标插入线，并标记头骨上的位置和插入位置旁边的锚螺钉的位置。

使用牙科钻头在每个站点钻出头骨，并使用操纵器轻轻插入光纤，直到光纤到达 BNST 上方。铁杉应该放在剩余的颅骨上。用锚螺钉将纤维固定在头骨上，注意不要破坏杜拉或损坏任何组织。

然后用光固化的牙科水泥盖住纤维和螺钉。接下来，钻孔为EEG/EMG电极，并将第一电极的尖端插入一个孔中。用一只手握住植入物，将氰丙烯酸酯粘合剂涂抹在头骨和电极之间的空间上，然后插入电极的其余部分，注意不要损坏任何组织。

放置所有电极后，用额外的氰丙烯酸酯粘合剂和氰丙烯酸酯助感覆盖电极和光纤的周长，以避免在电镀线上导致光纤电缆和电极与导线连接区域的任何中断。现在暴露颈部肌肉，并在肌肉下插入 EMG 电极的导线。调整 EMG 电极的长度，使其正好适合在 nuchal 肌肉下，并用更多的氰丙烯酸酯粘合剂和助剂填充植入物。

然后将鼠标放在带监控的热垫上，直到完全补偿。对于目标神经元的光激发期间的 EEG/EMG 监测，首先使用标量来调整激光强度，并使用铁杉将激光电缆的尖端系在未使用的光纤上。确认光纤和电缆之间的交汇点没有空格。

20分钟后，将预热激光发射到强度检查器，将强度调整为每毫米方的10毫瓦。将光脉冲持续时间设置为 10 毫秒，将余下周期设置为 40 毫秒，将周期设置为 20，重复设置为 20。将激光模式更改为晶体管逻辑，并确认光脉冲是由模纹稳压器控制的光纤发出的。

连接植入的电极和电缆适配器，然后用防光材料覆盖接头，防止激光泄漏。当激光准备就绪时，将小鼠移动到实验室进行脑电图/EMG 记录。要评估非快速眼动或快速眼动睡眠的觉醒延迟，请限制记录时间和优化的站点增益时间，让小鼠在实验室中自由移动至少一小时。

在实验期间，在同一记录屏幕中监控 EEG 和 EMG 信号。使用每个波的增益控制评估小鼠的状态为觉醒、非快速眼动睡眠或快速眼动睡眠，以便于区分每种状态。为了测量非快速眼动睡眠的觉醒延迟，观察稳定的非快速眼动睡眠40秒，然后打开模式发生器进行照片刺激，并确认激光发射到植入的光纤。

然后记录EEG/EMG信号，直到睡眠状态变化为觉醒。这里表示EEG/EMG跟踪之前和之后的照片刺激在非快速眼动睡眠显示。没有E动信号的高压和慢频EEG表示眼睛运动不快的睡眠。

照片刺激触发了在通道rhodopsin-2表达小鼠刺激后约两秒钟的急性过渡，而对照小鼠没有表现出这种过渡，这表明BNST GABA神经元在非快速眼动睡眠期间的激发触发了觉醒的快速诱导。相反，快速眼动睡眠期间的照片刺激没有效果，因此过渡效应只出现在非快速眼动睡眠中。重要的是要注意对病毒注射和光纤植入步骤的精确协调。

睡眠分析期间捕获的 EEG/EMG 轨迹可用于评估照片操作对小鼠不同警戒状态的影响。这项技术还将帮助我们识别其他组件和电路参与调节睡眠觉醒状态。使用护目镜避免激光损伤眼睛，并确保在使用后始终对腺相关病毒载体容器进行灭菌。