Эта процедура может помочь нам определить функцию конкретной нейро цепи, которые участвуют в регулировании бодрствования сна с менее инвазивными манипуляциями и высоким временным разрешением. Этот метод позволяет нам мониторинг поверхности ЭЭГ в режиме реального времени в сочетании с манипуляцией конкретной нейро цепи для изучения причинно-следственной связи между схемами и сон бодрствования государств. Шота Кодани собирается продемонстрировать процедуру.
После подтверждения отсутствия реакции на щепотку носа, нанесите мазь на глаза животного и используйте ушные батончики и носом булавку к стереотаксическому аппарату, чтобы стабилизировать голову обезболивающей мыши на абсорбющей площадке. Когда голова фиксируется в положении, сделать средне-sagittal разрез в кожу головы, чтобы подтвердить, что пересечение между сутура sagittalis и сутура coronalis или сутура lambdoidea находятся в горизонтальной линии на том же уровне. Чтобы избежать разрыва позиционирования, при необходимости отрегулируйте щепотку носа и ушные батончики.
Затем с помощью серафина зажимы для удержания кожи открыты дезинфицировать открытую поверхность черепа, чтобы черепные швы, которые будут визуализированы более четко. Для введения вектора вируса, связанного с адено, загрузите стерилизованный этанол 10 миллилитровым шприцем с двумя микролитровами минерального масла, после чего будет введен экспериментальный объем вируса. Используйте микроинъекцию насоса для регулировки кончика микроинъекции иглы на брегму и обратите внимание на координаты в качестве точки происхождения.
Затем перемести кончик в назначенное место инъекции и поместите кончик иглы в положение. Отметьте череп в месте инъекции и используйте зубную дрель, оснащенную карбидом 0,7 миллиметра, чтобы просверлить отверстие диаметром около двух миллиметров в черепе. После удаления крови со всего отверстия с помощью ватного тампона, медленно переместить иглу в ядро кровати стрии terminalis или BSNT и медленно вводить назначенный объем раствора вируса.
Затем оставьте иглу на месте в течение пяти минут, чтобы позволить раствору достаточно проникнуть в ткань BNST, прежде чем тщательно втягивать иглу. Для электроэнцефалограммы, или ЭЭГ, и электромиограммы, или ЭМГ, имплантации электродов, первый припой два провода из нержавеющей стали, из которых один миллиметр изоляции был лишен с обоих концов на электроды ЭМГ и место центр электродов на брегму. Затем отметь положение для каждого электрода ЭЭГ.
Чтобы определить положение имплантата оптического волокна, прикрепите к манипулятору феррул оптического волокна и поверните руку манипулятора на угол плюс-минус 30 градусов против горизонтальной линии. Положите наконечник волокна на брегму и запиши координаты. Перемести наконечник к целевой линии вставки и отметьте положение на черепе и положение для якорного винта рядом с местом вставки.
Используйте зубную дрель для бурения черепа на каждом участке и используйте манипулятор, чтобы аккуратно вставить оптическое волокно, пока оно не достигнет выше BNST. Феррул должен отдохнуть на оставшемся черепе. Закретись волокном к черепу якорным винтом, заботясь о том, чтобы не сломать дуру и не повредить салфетку.
Затем накройте волокно и винт фото-излечимым зубным цементом. Далее сверлит отверстия для электродов ЭЭГ/ЭМГ и вставляет кончик первого электрода в одно отверстие. Держа имплантат одной рукой, нанесите клей цианоакрилата в пространство между черепом и электродом и вставьте электрод на остальной части пути, заботясь о том, чтобы не повредить ни одну ткань.
Когда все электроды были размещены, покрыть окружность электродов и оптических волокон с дополнительными цианоакрилат клей и цианоакрилат ускоритель, чтобы избежать причинения каких-либо перерывов на ферруле для оптического кабеля и электрода, чтобы привести провода соединительных зон. Теперь разоблачить мышцы шеи, и вставить провода для эмГ электрода под мышцу. Отрегулируйте длину электрода ЭМГ так, чтобы он помещался прямо под нухальные мышцы и заполнял имплантаты более цианоакрилатным клеем и ускорителем.
Затем поместите мышь на тепловую площадку с мониторингом до полной компенсации. Для мониторинга ЭЭГ/ЭМГ во время фотовозбудения целевых нейронов, сначала используйте scalar для регулировки интенсивности лазера и использования феррула, чтобы привязать кончик лазерного кабеля к неиспользованной оптической клетчатке. Подтвердите, что на стыке волокна и кабеля нет места.
Через 20 минут, излучают разогретый лазер до интенсивности проверки и настроить интенсивность до 10 милливатт на миллиметр в квадрате. Установите продолжительность светового импульса до 10 миллисекунд, остальные периоды до 40 миллисекунд, цикл до 20, и повторить до 20. Измените лазерный режим на транзисторную логику и подтвердите, что световые импульсы испускаются из волокна, контролируемого регулятором шаблона.
Подключите имплантированный электрод и кабельный адаптер, а затем покройте соединение легким непроницаемым материалом для предотвращения утечки лазера. А когда лазер будет готов, переместите мышей в экспериментальную камеру для записи ЭЭГ/ЭМГ. Для оценки задержки бодрствования от не быстрого движения глаз или быстрого сна движения глаз, ограничить время записи и оптимизированный сайт получить время, и пусть мыши свободно перемещаться в экспериментальной камере, по крайней мере один час.
В течение экспериментального периода следите за сигналами ЭЭГ и ЭМГ на одном экране записи. Оцените состояние мыши как бодрствование, не быстрый сон движения глаз, или быстрый сон движения глаз, используя контроль усиления для каждой волны для удобства различения каждого состояния. Для измерения небывого сна движения глаз, чтобы бодрствования задержки, наблюдать стабильный не быстрый сон движения глаз в течение 40 секунд, а затем включить генератор шаблона для фотостимуляции и подтвердить лазерное излучение имплантированных оптических волокон.
Затем завестите сигналы ЭЭГ/ЭМГ до тех пор, пока состояние сна не изменится до бодрствования. Здесь представлены ЭЭГ / ЭМГ следы до и после фото стимуляции во время не быстрого сна движения глаз показаны. Высокое напряжение и медленная частота ЭЭГ без сигналов ЭМГ, представляет собой не быстрый сон движения глаз.
Фото стимуляции вызвало острый переход к бодрствования около двух секунд после стимуляции в channelrhodopsin-2 выражая мышей в то время как контроль мышей не продемонстрировать этот переход, предполагая, что возбуждение нейронов BNST ГАМК во время не быстрого движения глаз сна вызывает быструю индукцию бодрствования. И наоборот, фотостимуляция во время быстрого сна движения глаз не имела никакого эффекта, поэтому эффект перехода возник только при не быстром сне движения глаз. Важно позаботиться о точных координациях для инъекций вируса и этапов имплантации оптического волокна.
Следы ЭЭГ/ЭМГ, снятые во время анализа сна, могут быть использованы для оценки последствий фотомани манипуляций на различных бдительных состояниях у мышей. Этот метод также поможет нам определить другие компоненты и схемы, участвующие в регулировании состояния бодрствования сна. Используйте защитные очки, чтобы избежать лазерного повреждения глаза и не забудьте всегда автоклав стерилизовать адено-ассоциированный вирус вектор контейнера после использования.
