Este procedimiento puede ayudarnos a identificar la función de circuito neuro específico que intervienen en la regulación de la vigilia del sueño con menos manipulación invasiva y alta resolución temporal. Este método nos permite el monitoreo de la superficie EEG en tiempo real junto con la manipulación de un circuito neuro específico para examinar la relación causal entre los circuitos y los estados de vigilia del sueño. Shota Kodani va a demostrar el procedimiento.
Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, aplicar ungán al ojo del animal y utilizar las barras de oído y el pasador de la nariz en el aparato estereotáctico para estabilizar la cabeza del ratón anestesiado en una almohadilla absorbente. Cuando la cabeza esté fijada en su posición, haga una incisión de hundimiento medio en el cuero cabelludo para confirmar que la intersección entre la sutura sagittalis y la sutura coronalis o sutura lambdoidea están en una línea horizontal al mismo nivel. Para evitar un espacio de posicionamiento, ajuste el pellizco de la nariz y las barras de las orejas según sea necesario.
Luego, usando abrazaderas de serafína para mantener la piel abierta desinfectar la superficie expuesta del cráneo para permitir que las suturas craneales se visualicen más claramente. Para inyectar el vector del virus asociado al adeno, cargue una jeringa esterilizada con etanol de 10 mililitros con dos microlitros de aceite mineral, seguido del volumen experimental del virus que se va a inyectar. Utilice la bomba de microinyección para ajustar la punta de la aguja de microinyección en el bregma y observe las coordenadas como el punto de origen.
A continuación, mueva la punta al lugar de inyección designado y coloque la punta de la aguja en la posición. Marque el cráneo en el lugar de inyección y utilice un taladro dental equipado con un cortador de carburo de 0,7 milímetros para perforar un agujero de aproximadamente dos milímetros de diámetro en el cráneo. Después de extraer sangre de alrededor del agujero con un hisopo de algodón, mueva lentamente la aguja al núcleo de la cama de la estrías terminalis o BSNT e inyecte lentamente el volumen designado de solución ánltica.
A continuación, deje la aguja en su lugar durante cinco minutos para permitir que la solución se infiltre lo suficiente en el tejido BNST antes de retraer cuidadosamente la aguja. Para electroencefalograma, o EEG, y electromiograma, o EMG, implantación de electrodos, primero soldar dos alambres de acero inoxidable de los cuales se ha despojado un milímetro de aislamiento de ambos extremos a los electrodos EMG y colocar el centro de los electrodos en el bregma. A continuación, marque la posición de cada electrodo EEG.
Para determinar la posición del implante de fibra óptica, conecte una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo manipulador a un ángulo más o menos de 30 grados contra una línea horizontal. Ponga la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas. Mueva la punta a la línea de inserción objetivo y marque la posición en el cráneo y la posición del tornillo de anclaje junto al sitio de inserción.
Utilice el taladro dental para perforar el cráneo en cada sitio y utilice el manipulador para insertar suavemente la fibra óptica hasta que llegue por encima del BNST. La férula debe descansar sobre el cráneo restante. Fije la fibra al cráneo con un tornillo de anclaje, teniendo cuidado de no romper la dura o dañar ningún tejido.
A continuación, cubra la fibra y atornille con cemento dental fotocurable. A continuación, taladre agujeros para electrodos EEG/EMG e inserte la punta del primer electrodo en un orificio. Sosteniendo el implante con una mano, aplicar adhesivo de cianoacrilato al espacio entre el cráneo y el electrodo e insertar el electrodo el resto del camino, teniendo cuidado de no dañar ningún tejido.
Cuando se hayan colocado todos los electrodos, cubra la circunferencia de los electrodos y las fibras ópticas con adhesivo adicional de cianoacrilato y acelerador de cianoacrilato para evitar causar cualquier interrupción en la férula al cable óptico y electrodo a las zonas de conexión del cable de plomo. Ahora exponga los músculos del cuello e inserte los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG de modo que encaje justo debajo de los músculos nucales y llene los implantes con más adhesivo y acelerador de cianoacrilato.
A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla de calor con monitoreo hasta que se recompensa completa. Para la monitorización de EEG/EMG durante la fotoexcitación de neuronas dirigidas, primero utilice un escalar para ajustar la intensidad del láser y utilice una férula para amarrar la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada. Confirme que no hay espacio en la unión entre la fibra y el cable.
Después de 20 minutos, emita el láser calentado al comprobador de intensidad y ajuste la intensidad a 10 milivatios por milímetro cuadrado. Establezca la duración del pulso de luz en 10 milisegundos, el período de descanso en 40 milisegundos, el ciclo en 20 y la repetición en 20. Cambie el modo láser a la lógica del transistor y confirme que los pulsos de luz se emiten desde la fibra controlada por el regulador del patrón.
Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable y, a continuación, cubra la unión con material impermeable ligero para evitar fugas de láser. Y cuando el láser esté listo, mueva los ratones a la cámara experimental para la grabación EEG/EMG. Para evaluar la latencia a la vigilia de movimiento ocular no rápido o sueño de movimiento ocular rápido, limite el tiempo de grabación y el tiempo de ganancia optimizado del sitio y deje que los ratones se muevan libremente en la cámara experimental durante al menos una hora.
Durante el período experimental, monitoree las señales EEG y EMG en la misma pantalla de grabación. Evalúe el estado del ratón como vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido o sueño de movimiento ocular rápido usando el control de ganancia para cada onda para facilitar la distinción de cada estado. Para la medición del sueño de movimiento ocular no rápido a la latencia de vigilia, observe el sueño estable de movimiento ocular no rápido durante 40 segundos, luego encienda el generador de patrones para la estimulación fotográfica y confirme la emisión láser a las fibras ópticas implantadas.
A continuación, registre las señales EEG/EMG hasta que el estado de suspensión cambie a vigilia. Aquí se muestran rastros de EEG/EMG representados antes y después de la estimulación fotográfica durante el sueño no rápido del movimiento ocular. Un EEG de alto voltaje y frecuencia lenta sin señales EMG, representa el sueño no rápido del movimiento ocular.
La estimulación fotográfica desencadenó una transición aguda a la vigilia unos dos segundos después de la estimulación en ratones que expresan la canalización-2 mientras que los ratones de control no demostraron esta transición, lo que sugiere que la excitación de las neuronas BNST GABA durante el sueño de movimiento ocular no rápido desencadena una rápida inducción de vigilia. Por el contrario, la estimulación fotográfica durante el sueño de movimiento ocular rápido no tuvo ningún efecto, por lo que un efecto de transición sólo surgió en el sueño de movimiento ocular no rápido. Es importante tener cuidado con las coordinaciones precisas para la inyección de virus y los pasos de implantación de fibra óptica.
Los rastros EEG/EMG capturados durante el análisis del sueño se pueden utilizar para evaluar las consecuencias de la manipulación de la foto en los diferentes estados vigilantes en ratones. Esta técnica también nos ayudará a identificar otros componentes y circuitos involucrados en la regulación de los estados de vigilia del sueño. Utilice gafas protectoras para evitar daños por láser en el ojo y asegúrese de esterilizar siempre el autoclave el contenedor vectorial de virus asociado al adeno después de su uso.
