Bu prosedür bize daha az invaziv manipülasyon ve yüksek zamansal çözünürlük ile uyku uyanıklık düzenleme dahil belirli nöro devrenin işlevini belirlemenize yardımcı olabilir. Bu yöntem bize devreler ve uyku uyanıklık durumları arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için belirli bir nöro devre manipülasyon ile birlikte gerçek zamanlı izleme yüzeyi EEG sağlar. Shota Kodani prosedürü gösterecek.
Ayak ucurmesine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın ve kulak çubuklarını ve burun pimini stereotaktik cihaza kullanarak anestezili farenin başını emici bir ped üzerinde sabitle. Kafa pozisyonda sabitlendiğinde, sutura sagittalis ve sutura coronalis veya sutura lambdoidea arasındaki kesişme aynı düzeyde yatay bir çizgi de olduğunu doğrulamak için kafa derisi bir orta sagittal kesi yapmak. Konumlandırma boşluğundan kaçınmak için, burun kıskacını ve kulak çubuklarını gerektiği gibi ayarlayın.
Daha sonra kafatası dikişlerinin daha net görüntülemesini sağlamak için kafatasının açık yüzeyini dezenfekte etmek için cilde açık tutmak için serafin kelepçeler kullanarak. Adeno ile ilişkili virüs vektörü enjekte etmek için, iki mikrolitre mineral yağ ile sterilize edilmiş bir etanol yükleyin, ardından enjekte edilecek virüsün deneysel hacmi. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu bregma üzerine ayarlamak için mikroenjeksiyon pompasını kullanın ve koordinatları çıkış noktası olarak not edin.
Daha sonra ucu belirlenen enjeksiyon bölgesine taşıyın ve iğnenin ucunu pozisyona yerleştirin. Enjeksiyon yerinde kafatası işaretlemek ve kafatası içine yaklaşık iki milimetre çapında delik delmek için 0,7 milimetre karbür kesici ile donatılmış bir diş matkap kullanın. Pamuklu bir bezle deliğin etrafındaki kanı çıkardıktan sonra, iğneyi yavaşça stria terminalis veya BSNT'nin yatak çekirdeğine taşıyın ve belirlenen virüs çözeltisini yavaşça enjekte edin.
Daha sonra çözeltinin iğneyi dikkatlice geri çekmeden önce BNST dokusuna yeterince sızmasına izin vermek için iğneyi beş dakika yerinde bırakın. Elektroensefalogram veya EEG, ve elektromiyogram veya EMG, elektrot implantasyonu için, ilk lehim iki paslanmaz çelik teller hangi yalıtım bir milimetre eMG elektrotlar için her iki ucundan sıyrılmış ve bregma üzerine elektrotların merkezi yerleştirin. Daha sonra her EEG elektrot için konumu işaretleyin.
Optik fiber implantın konumunu belirlemek için, manipülatöre optik fiber ferrule takın ve manipülatör kolunu yatay bir çizgiye karşı artı veya eksi 30 derecelik açıya döndürün. Fiber ucunu bregma'ya koy ve koordinatları kaydet. Ucu hedeflenen ekleme hattına taşıyın ve kafatasıüzerindeki konumu ve ekleme bölgesinin yanındaki çapa vidasının konumunu işaretleyin.
Her sitede kafatası matkap ve bnst üzerinde ulaşana kadar yavaşça optik fiber eklemek için manipülatör kullanın diş matkap kullanın. Ferrule kalan kafatası üzerinde dinlenmeli. Bir çapa vida ile kafatasına lif güvenli, dura kırmak veya herhangi bir doku zarar değil dikkat.
Sonra lif kapağı ve fotoğraf tedavi edilebilir diş çimentosu ile vida. Daha sonra, EEG/EMG elektrotları için delikler açve ilk elektrotun ucunu bir deliğe takın. İmplantı tek elle tutarak, kafatası ile elektrot arasındaki boşluğa siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve elektrodu yolun geri kalanında takın, herhangi bir dokuya zarar vermemeye özen takın.
Tüm elektrotlar yerleştirildiğinde, elektrotların ve optik liflerin çevresini ek siyanoakrilat yapıştırıcı ve siyanoakrilat hızlandırıcı ile kaplayın ve kablo bağlantı bölgelerine kablo ve elektrot için ferrule'de herhangi bir kesintiye neden olmasını önleyebilirsiniz. Şimdi boyun kaslarını ortaya çıkar ve kas Altında EMG elektrot için telleri takın. EMG elektrotunun uzunluğunu, ense kaslarının hemen altına sığacak şekilde ayarlayın ve implantları daha siyanoakrilat yapıştırıcı ve hızlandırıcı ile doldurun.
Sonra tam telafi kadar izleme ile bir ısı yastığı üzerinde fare yerleştirin. Hedeflenen nöronların foto uyarma sırasında EEG / EMG izleme için, ilk lazer yoğunluğunu ayarlamak için bir skaler kullanın ve kullanılmayan bir optik fiber lazer kablosuucu tether için bir ferrule kullanın. Fiber ve kablo arasındaki kavşakta boşluk olmadığını doğrulayın.
20 dakika sonra, yoğunluk denetleyicisi için ısıtılmış lazer yayarlar ve milimetre kare başına 10 miliwatt yoğunluğunu ayarlayın. Işık darbe süresini 10 milisaniyeye, geri kalan süreyi 40 milisaniyeye, döngüyü 20'ye ve tekrarı 20'ye ayarlayın. Lazer modunu transistör mantığıyla değiştirin ve ışık darbelerinin desen regülatörü tarafından kontrol edilen fiberden yayılarak yayLıp,
İmplante edilmiş elektrot ve kablo adaptörünü bağlayın ve lazer sızıntısını önlemek için kavşağı ışık geçirimsiz malzemeyle kaplayın. Lazer hazır olduğunda fareleri EEG/EMG kaydı için deney odasına taşıyın. Hızlı olmayan göz hareketi veya hızlı göz hareketi uyku uyanıklık için gecikme değerlendirmek için, kayıt süresini sınırlamak ve optimize site kazanç süresi ve fareler en az bir saat boyunca deneysel odada serbestçe hareket sağlar.
Deney süresi boyunca, EEG ve EMG sinyallerini aynı kayıt ekranında izleyin. Her durumu ayırt etme kolaylığı için her dalga için kazanç kontrolünü kullanarak farenin durumunu uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi uykusu veya hızlı göz hareketi uykusu olarak değerlendirin. Uyanıklık gecikmesi için hızlı olmayan göz hareketi uyku ölçümü için, 40 saniye boyunca istikrarlı non rapid göz hareketi uyku gözlemlemek, sonra fotoğraf stimülasyonu için desen jeneratör açın ve implante optik lifleriçin lazer emisyon onaylamak.
Ardından Uyku durumu uyanıklığa geçene kadar EEG/EMG sinyallerini kaydedin. Burada hızlı olmayan göz hareketi uykusırasında fotoğraf stimülasyonu öncesi ve sonrası EEG/EMG izleri gösterilmiştir. EMG sinyali olmayan yüksek voltajlı ve yavaş frekanslı EEG, hızlı olmayan göz hareketi uykusu dur.
Fotoğraf stimülasyonu kanaloidpsin-2'de uyarılmayı takiben uyanıklığa akut geçişi tetikledi kontrol fareleri bu geçişi göstermezken, hızlı olmayan göz hareketi uykusunda BNST GABA nöronların uyarılmasının uyanıklığın hızlı bir indüksiyonunu tetiklediğini düşündürmektedir. Tersine, hızlı göz hareketi uyku sırasında fotoğraf stimülasyonu bir geçiş etkisi sadece hızlı olmayan göz hareketi uyku ortaya çıktı bu yüzden hiçbir etkisi yoktu. Bu virüs enjeksiyonu ve optik fiber implantasyon adımları için hassas koordinasyon dikkat etmek önemlidir.
Uyku analizi sırasında yakalanan EEG/EMG izleri, farelerdeki farklı uyanık hallerde fotoğraf manipülasyonunun sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda uyku uyanıklık durumlarını düzenleyen ilgili diğer bileşenleri ve devreleri belirlememize yardımcı olacaktır. Göze lazer hasarı önlemek için koruyucu gözlük kullanın ve her zaman otoklav kullanımdan sonra adeno ilişkili virüs vektör konteyner sterilize emin olun.
