Cette procédure peut nous aider à identifier la fonction du circuit neuro spécifique qui sont impliqués dans la régulation de l’éveil du sommeil avec une manipulation moins invasive et une résolution temporelle élevée. Cette méthode nous permet de surveiller l’EEG de surface en temps réel en conjonction avec la manipulation d’un circuit neuro spécifique pour examiner la relation causale entre les circuits et les états d’éveil du sommeil. Shota Kodani va démontrer la procédure.
Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et utilisez les barres d’oreille et la goupille du nez à l’appareil stéréotaxique pour stabiliser la tête de la souris anesthésiée sur un coussin absorbant. Lorsque la tête est fixée en position, faire une incision mi-sagittale dans le cuir chevelu pour confirmer que l’intersection entre la sutura sagittalis et sutura coronalis ou sutura lambdoidea sont dans une ligne horizontale au même niveau. Pour éviter un écart de positionnement, ajustez le pincement du nez et les barres d’oreille au besoin.
Ensuite, l’utilisation de pinces de sérafin pour maintenir la peau ouverte désinfecte la surface exposée du crâne pour permettre aux sutures crâniens d’être visualisées plus clairement. Pour injecter le vecteur du virus associé à l’adéno, chargez une seringue stérilisée à l’éthanol de 10 millilitres avec deux microlitres d’huile minérale, suivie du volume expérimental de virus à injecter. Utilisez la pompe à microinjection pour régler la pointe de l’aiguille de microinjection sur la brème et notez les coordonnées comme point d’origine.
Déplacez ensuite la pointe vers le site d’injection désigné et placez le bout de l’aiguille sur la position. Marquez le crâne au site d’injection et utilisez une perceuse dentaire munie d’un cutter carbure de 0,7 millimètre pour percer un trou d’environ deux millimètres de diamètre dans le crâne. Après avoir retiré le sang autour du trou à l’aide d’un coton-tige, déplacez lentement l’aiguille vers le noyau du lit de la stria terminalis ou BSNT et injectez lentement le volume désigné de solution virale.
Laissez ensuite l’aiguille en place pendant cinq minutes pour permettre à la solution de s’infiltrer suffisamment dans le tissu BNST avant de retirer soigneusement l’aiguille. Pour l’électroencéphalogramme, ou EEG, et l’électromyogramme, ou EMG, implantation d’électrodes, d’abord soudeur deux fils en acier inoxydable à partir de laquelle un millimètre d’isolation a été dépouillé des deux extrémités aux électrodes EMG et placer le centre des électrodes sur le bregma. Marquez ensuite la position de chaque électrode EEG.
Pour déterminer la position de l’implant de fibre optique, fixez une fibre optique ferrule au manipulateur et faites pivoter le bras manipulateur à un angle de plus ou moins 30 degrés contre une ligne horizontale. Mettez la pointe de fibre sur le bregma et enregistrez les coordonnées. Déplacez la pointe vers la ligne d’insertion ciblée et marquez la position sur le crâne et la position de la vis d’ancrage à côté du site d’insertion.
Utilisez la perceuse dentaire pour percer le crâne à chaque emplacement et utilisez le manipulateur pour insérer doucement la fibre optique jusqu’à ce qu’elle atteigne au-dessus du BNST. La ferrule doit reposer sur le crâne restant. Fixez la fibre au crâne avec une vis d’ancrage, en prenant soin de ne pas casser le dura ou endommager les tissus.
Couvrez ensuite la fibre et vissez avec du ciment dentaire photo-curable. Ensuite, percer des trous pour les électrodes EEG/EMG et insérer la pointe de la première électrode dans un trou. En tenant l’implant d’une main, appliquez l’adhésif cyanoacrylate sur l’espace entre le crâne et l’électrode et insérez l’électrode le reste du chemin, en prenant soin de ne pas endommager les tissus.
Lorsque toutes les électrodes ont été placées, couvrir la circonférence des électrodes et des fibres optiques d’adhésifs cyanoacrylates supplémentaires et d’accélérant cyanoacrylate afin d’éviter de causer une interruption à la ferrule du câble optique et de l’électrode pour diriger les zones de raccordement des fils. Maintenant exposer les muscles du cou, et insérer les fils pour l’électrode EMG sous le muscle. Ajustez la longueur de l’électrode EMG de sorte qu’elle s’adapte juste sous les muscles nuchal et remplissez les implants avec plus d’adhésif cyanoacrylate et d’accélérant.
Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la pleine récompense. Pour la surveillance eEG/EMG pendant la photo-excitation des neurones ciblés, utilisez d’abord un scalaire pour ajuster l’intensité laser et utiliser un ferrule pour attacher la pointe du câble laser à une fibre optique inutilisée. Confirmez qu’il n’y a pas d’espace à la jonction entre la fibre et le câble.
Après 20 minutes, émettre le laser réchauffé au contrôle d’intensité et ajuster l’intensité à 10 milliwatts par millimètre au carré. Réglez la durée de l’impulsion lumineuse à 10 millisecondes, la période de repos à 40 millisecondes, le cycle à 20, et la répétition à 20. Changez le mode laser en logique transistor et confirmez que les impulsions lumineuses sont émises par la fibre contrôlée par le régulateur de motifs.
Connectez l’électrode implantée et l’adaptateur de câble, puis couvrez la jonction avec le matériel imperméable à la lumière pour empêcher la fuite de laser. Et lorsque le laser est prêt, déplacez les souris vers la chambre expérimentale pour l’enregistrement EEG/EMG. Pour évaluer la latence à l’éveil du mouvement oculaire non rapide ou du sommeil rapide de mouvement d’oeil, limitez le temps d’enregistrement et le temps optimisé de gain de site et laissez les souris se déplacer librement dans la chambre expérimentale pendant au moins une heure.
Pendant la période expérimentale, surveillez les signaux EEG et EMG dans le même écran d’enregistrement. Évaluez l’état de la souris comme l’éveil, le sommeil non rapide de mouvement d’oeil, ou le sommeil rapide de mouvement d’oeil utilisant le contrôle de gain pour chaque vague pour la facilité de distinguer chaque état. Pour mesurer le sommeil non rapide de mouvement d’oeil à la latence d’éveil, observez le sommeil stable non rapide de mouvement d’oeil pendant 40 secondes, puis allumez le générateur de modèle pour la stimulation de photo et confirmez l’émission de laser aux fibres optiques implantées.
Enregistrez ensuite les signaux EEG/EMG jusqu’à ce que l’état du sommeil change en éveil. Ici, des traces d’EEG/EMG représentées avant et après la stimulation de photo pendant le sommeil non rapide de mouvement d’oeil sont montrées. Un EEG à haute tension et à fréquence lente, sans signaux EMG, représente un sommeil non rapide du mouvement oculaire.
La stimulation photo a déclenché une transition aiguë à l’éveil environ deux secondes après stimulation dans channelrhodopsin-2 exprimant des souris tandis que les souris témoins n’ont pas démontré cette transition, suggérant que l’excitation des neurones de GABA de BNST pendant le sommeil non rapide de mouvement d’oeil déclenche une induction rapide de l’éveil. Inversement, la stimulation photo pendant le sommeil rapide de mouvement d’oeil n’a eu aucun effet ainsi un effet de transition a seulement émergé dans le sommeil non rapide de mouvement d’oeil. Il est important de prendre soin de coordinations précises pour les étapes d’injection de virus et d’implantation de fibres optiques.
Les traces EEG/EMG capturées au cours de l’analyse du sommeil peuvent être utilisées pour évaluer les conséquences de la manipulation de la photo sur les différents états vigilants chez la souris. Cette technique nous aidera également à identifier d’autres composants et circuits impliqués dans la régulation des états d’éveil du sommeil. Utilisez des lunettes de protection pour éviter les dommages au laser à l’œil et assurez-vous de toujours autoclave stériliser le récipient vecteur de virus associé à l’adéno après utilisation.
