신경 줄기와 전구 세포는 자가 갱신하고 다른 신경 세포 모형으로 분화할 수 있고, 신경계 발달을 지원하고 재생 의학을 위한 자원을 제안할 수 있습니다. 이 세포는 이질적이며, 우리는 정제된 세포 인구를 얻고 그들의 기능을 이해하기 위하여 그들의 특정 세포 표면 마커를 알아야 합니다. 우리의 프로토콜은 1 차신경줄기 및 선조 세포의 막 단백질을 분석하는 간단하고 민감하고 효율적인 기술을 제공하여 이러한 세포에 대한 새로운 표면 마커를 식별하는 데 도움을 줍니다.
우리의 프로토콜의 주요 장점은 개선 된 감도와 특이성을 가진 1 차신경 줄기 및 선조 세포의 표면 프로테아움을 직접 분석하는 능력입니다. 이는 체외 내막 세포 내의 공동 배양을 통해 이를 확대하고 고장체 내성 셀라기 MAPK-ERK 통로를 통해 표면 포린에 라벨을 부착함으로써 달성된다. 시험관 내 줄기 세포를 확장하는 데 대한 모공 프로 수정으로, 우리의 프로토콜은 다른 줄기 세포 유형의 표면 마커를 식별하기 위해 쉽게 적용 될 수 있습니다.
내피 세포를 준비하기 위해 BEN3 세포 배지의 9 밀리리터와 90%의 합류로 10센티미터 페트리 접시에서 BEN3 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 서스펜션 1밀리리터를 하나의 투과성 지지성 인서트로 추가합니다. 매트릭스의 하단 챔버에 잘 당 BEN3 배지의 또 다른 두 밀리리터를 추가합니다.
이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 하루 동안 세포를 배양합니다. 인서츠에 세포를 도금한 지 하루 후, 배지를 부드럽게 흡인시키고, 먼저 아래챔버에서, 그리고 인서츠에서 흡입한다. 사전 따뜻하게 데운 DMEM으로 인서츠의 얼굴을 세 번 씻으시다.
미리 데워진 DMEM으로 헹구어 인서츠의 바깥쪽 표면을 씻으시다. 다음으로 미리 따뜻해지는 AM 1밀리리터를 하나의 인서트로 추가합니다. 1차 피질 세포를 통해 인서트를 우물안으로 옮킨다.
12시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 공동 배양합니다. DMSO에 Ac4ManAz를 용해하여 200 밀리머의 재고 농도를 달성하십시오. 인큐베이터에서 신경 내피 공동 배양 판을 검색합니다.
각 하단 챔버에 Ac4ManAz 스톡의 마이크로리터 1개, 인서트당 0.5 마이크로리터를 공동 배양에 넣습니다. 5일 동안 5%의 이산화탄소로 37도에서 세포를 배양합니다. 세포가 배양되는 동안 삽입당 RM 100 마이크로리터와 200마이크로리터의 RM리터를 바닥 챔버당 첨가하여 격일로 내피 및 신경 세포를 다시 공급합니다.
먼저 공동 배양 플레이트에서 인서트를 제거하고 우물 의 바닥에서 배양 배지를 흡인합니다. 다음으로 미리 따뜻해진 PBS로 신경 세포를 한 번 씻으시면 됩니다. 우물에서 PBS를 흡인하고 PBS에 미리 차가운 4 % 파라 포름알데히드의 1 밀리리터를 각각 잘 넣습니다.
실온에서 셀을 10분 동안 수정합니다. 그런 다음 미리 차가운 PBS로 셀을 세 번 씻으세요. PBS를 흡인하고 새로 준비된 비오틴 공액 버퍼 1의 1밀리리터를 각 웰에 넣습니다.
실온에서 10분 동안 배양하세요. 그 후, 우물에서 반응 버퍼를 흡인하고 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 각 셀 웰에 염색 버퍼 1밀리리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
다음으로, 우물에서 염색 버퍼를 흡인하고 미리 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 각 셀 웰에 버퍼를 차단하는 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 우물에서 차단 버퍼를 제거하고 각 우물에 1 차적인 항체 용액의 1 밀리리터를 추가합니다.
하룻밤 사이에 세포를 섭씨 4도에서 배양합니다. 다음 날, 우물에서 1 차적인 항체 용액을 제거하십시오. 미리 차가운 PBS로 셀을 세 번 씻으세요.
우물에서 PBS를 흡인 하 고 각 잘에 이차 항체의 1 밀리 리터를 추가. 실온에서 2시간 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 우물에서 용액을 흡인하고 미리 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻는다.
먼저, BTTAA 컵릭 황산복합체 2, 전체 단백질 재서스펜션 버퍼, 단백질 세척 완충제 1, 단백질 세척 완충제 2 및 단백질 세척 완충제 3을 텍스트 프로토콜에 설명한 대로 준비한다. 다음으로 공동 배양 플레이트에서 인서트를 제거합니다. 배양 배지를 바닥 우물에서 흡인시키고 미리 냉각된 PBS로 신경 세포를 한 번 씻으세요.
PBS를 흡인하고 각 우물에 미리 냉각된 RIPA 버퍼 200 마이크로리터를 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 접시를 배양 한 다음 1.5 밀리리터 튜브로 단백질 용액을 수집합니다. 원심분리기는 12000배, 섭씨 4도에서 10분간 세포 잔해를 배출합니다.
새로운 1.5 밀리 리터 튜브로 상체를 전송 하 고 제조 업체 지침에 따라 BCA 키트와 단백질 농도 결정. 그런 다음 밀리리터당 단백질 농도를 1밀리그램으로 조절합니다. 100 마이크로몰라 알키드 비오틴, 2.5 밀리머 나트륨 아스코르베이트 및 1XBTTAA 컵릭 황산 복합체 2 ~ 1 밀리리터 단백질 용액을 추가합니다.
용액을 잘 섞고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하십시오. 그 후, 50 밀리리터 원추형 튜브에서 미리 냉각된 메탄올의 20 밀리리터로 반응 용액을 전달한다. 잘 섞고 밤새 영하 30도에서 배양하여 단백질을 침전시합니다.
원심분리기는 4,500배 G, 섭씨 4도에서 15분간 단백질 침전을 유발합니다. 세척당 20밀리리터의 미리 차가운 메탄올을 사용하여 펠릿을 두 번 씻으십시오. 다음으로, 슈퍼나탄을 흡인시키고 다시 서스펜션 버퍼의 4밀리리터에서 단백질 펠릿을 다시 중단한다.
단백질 재서스펜션을 새로운 15 밀리리터 원내 튜브로 옮는다. PBS로 50 마이크로리터의 스트렙타비딘 구슬을 세 번 씻으시다. 세척된 구슬을 단백질 재서스펜션에 넣고 20rpm의 회전 속도로 수직 회전기에서 섭씨 4도에서 3시간 동안 용액을 배양합니다.
그 후, 여기에 표시된 각 세척 버퍼로 구슬을 순차적으로 세척하십시오. 세척된 구슬을 PBS 20마이크로리터로 다시 중단하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨넣습니다. 2X 단백질 로딩 버퍼20마이크로리터를 넣고 섭씨 95도에서 10분간 치료하십시오.
그런 다음 SDS-PAGE로 단백질 샘플을 처리하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 쿠마시 브릴리언트 블루로 얼룩지게 합니다. 이 연구에서 1 차적인 배아 NSPC는 시험관내에서 확장되고 대사적으로 표지됩니다. 성공적인 내피 공동 배양은 NSPC가 큰 시트와 같은 클론을 형성하도록 이끕니다.
항체를 가진 면역 염색은 클론에서, 세포의 대부분은 네스티인 양성 NSPC이다는 것을, 아주 몇몇은 베타 tubulin 3 양성 신경 세포입니다. 대조적으로, 네신 양성 세포및 베타 튜룰린의 백분율3 비 공동 배양 시스템에서 형성된 클론에 있는 양성 신경 세포는 거의 동일합니다. 화학 기자 Ac4ManAz는 신진 대사 아날로그이며 본질적인 단백질 실화 경로에 통합 될 수 있습니다.
1차 NSPC를 위한 100 마이크로몰러의 최적화된 라벨링 농도가 사용되고 세포 및 핵 형태학에 의해 표시된 세포 사멸의 조합 평가는 이 라벨링 농도가 명백한 세포독성 효과를 일으키지 않으며 NSPC에 효율적으로 라벨을 붙일 수 있음을 시사한다. 내피 동배 및 비공동배양 시스템 모두에서 NSPC의 복제 형태, 자기 갱신 및 분화 잠재력은 영향을 받지 않는다. Biotin 컨쥬게이션및 스트렙타비딘 비즈 정화에 의해 Ac4ManAz 표지 배양에서 제조된 단백질 샘플은 SDS-PAGE 젤에서 강한 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 신호를 보여줍니다.
한편 DMSO 대조군에서 단백질 샘플로 로드된 차선에 얼룩진 배경 및 비특이적 결합 신호만 있었습니다. 이는 또한 Ac4ManAz에 의한 NSPC의 효율적인 라벨링을 나타냅니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 생체 세포 반응에 필요한 모든 해결책은 신선하게 준비되어야 하고 반응 시간은 불충분한 반응의 과잉을 방지하기 위하여 단단히 통제되어야 합니다.
우리의 프로토콜에 따라 신경 줄기 세포의 구조가 농축 된 표면 글리칸을 분석 할 수 있습니다. 신경 줄기 및 전구 농축 표면 단백질의 우리의 프로토콜은 마커를 상승뿐만 아니라 제기 패턴 정화 전략과이 세포 집단에 대한 강성 신호 회로의 그림에 중요한 기능을 재생합니다.
