Sinirsel kök ve progenitor hücreleri kendini yenilemek ve farklı nöral hücre tipleri içine ayırt, sinir sistemi gelişimini destekleyen ve rejeneratif tıp için bir kaynak sunan. Bu hücreler heterojendir ve arınmış hücre popülasyonları elde etmek ve işlevlerini anlamak için onların özel hücre yüzeyi işaretlerini bilmemiz gerekir. Protokolümüz, primer nöral kök ve progenitor hücrelerin membran proteinlerini analiz etmek için basit, hassas ve etkili bir teknik sağlayarak bu hücreler için yeni yüzey belirteçlerinin belirlenmesine yardımcı olur.
Protokolümüzün en büyük avantajı, primer nöral kök ve ata hücrelerinin yüzey proteomunu gelişmiş duyarlılık ve özgüllükle doğrudan analiz edebilmeyeteneğidir. Bu, yüzey kirpiklerini etiketlemek için in vitro ve yüksek traktör içsel hücreleşme MAPK-ERK yolu içinde endotel hücreleri içinde co-kültür yoluyla genişleterek elde edilir. İn vitro kök hücrelerin genişletilmesi gözenek pro-değişiklikler ile, bizim protokol kolayca diğer kök hücre türlerinin yüzey belirteçleri belirlemek için uygulanabilir.
Endotel hücrelerini hazırlamak için, 10 santimetrelik Petri kabından ben3 hücreli bir peleti %90'lık bir kesişme ile dokuz mililitre BEN3 hücre linesi ile yeniden askıya alın. Geçirilebilir bir destek ucuna bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Matrisin alt haznesinde her iki mililitre ben3 orta ekleyin.
Hücreleri bir gün boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kültüre almaya devam edin. Eklerdeki hücreleri kaplamadan bir gün sonra, önce alt odadan, sonra kesici uçlardan ortayı hafifçe aspire edin. Uçların yüzünü önceden ısıtılmış DMEM ile üç kez yıkayın.
Önceden ısıtılmış DMEM ile durulayarak kesici uçların dış yüzeyini yıkayın. Ardından, bir ekleme içine önceden ısıtılmış bir mililitre ekleyin. Eklerin birincil kortikal hücrelerle kuyulara aktarılması.
Ortak kültürü 37 derecede 12 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. 200 milimolar bir stok konsantrasyonu elde etmek için DMSO Ac4ManAz çözün. Nöral endotel ortak kültür plakasını kuvözden alın.
Her alt hazneye bir mikrolitre Ac4ManAz stoğu ve ortak kültüre kesici uç başına 0,5 mikrolitre ekleyin. Kültür hücreleri 37 santigrat derecede 5 gün boyunca%5 karbondioksit ile. Hücreler kültüroluştururken, her gün endotel ve sinir hücrelerini yeniden beslemek için kesici uç başına 100 mikrolitre RM ve alt oda başına 200 mikrolitre RM ekleyin.
Önce ortak kültür plakalarından ekler çıkarın ve kuyuların altından kültür ortamı aspire. Daha sonra önceden ısıtılmış PBS ile sinir hücrelerini bir kez yıkayın. Kuyulardan PBS aspire ve her kuyuya PBS önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit bir mililitre ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Daha sonra hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. PBS aspirate ve her kuyuiçine taze hazırlanmış biotin konjuge tampon 1 bir mililitre ekleyin.
10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kuyulardan reaksiyon tamponaspire ve PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Hücrelerin her kuyusuna bir mililitre boyama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, kuyulardan boyama tamponaspire ve önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Hücrelerin her kuyusuna bir mililitre engelleme tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuyulardan engelleme tamponu çıkarın ve her kuyuya bir mililitre birincil antikor çözeltisi ekleyin.
Hücreleri bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kuyulardan birincil antikor solüsyonu çıkarın. Önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
Kuyulardan PBS aspire ve her kuyuya ikincil antikor bir mililitre ekleyin. Hücreleri iki saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kuyulardan çözelti aspire ve önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
İlk olarak BTTAA cupric sülfat kompleksi 2, tam protein re-süspansiyon tamponu, protein yıkama tamponu 1, protein yıkama tamponu 2 ve protein yıkama tamponu 3'ün metin protokolünde belirtildiği şekilde hazırlayın. Ardından, eklerin ortak kültür plakalarından çıkarılmasını. Alt kuyulardan kültür ortamıaspire ve önceden soğutulmuş PBS ile bir kez nöral hücreleri yıkayın.
PBS aspire ve her kuyuya önceden soğutulmuş RIPA tampon 200 mikrolitre ekleyin. Plakaları beş dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve protein lisisi 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. 12000 kez G ve dört santigrat derecede hücre enkazını peletlemek için 10 dakika santrifüj.
Supernatant'ı yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve üreticilerin talimatlarına göre bca kiti ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Daha sonra, mililitre başına bir miligram protein konsantrasyonu ayarlayın. 100 mikromolar alkyde biotin, 2.5 milimolar sodyum askorbat ve 1XBTTAA cuprik sülfat kompleksi 2 ila bir mililitre protein lisis ekleyin.
Çözeltiyi iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüp içinde önceden soğutulmuş metanol 20 mililitre içine reaksiyon çözeltisi aktarın. Proteinleri çökeltmek için iyi karıştırın ve eksi 30 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.
Santrifüj 4500 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca protein çökelti pelet. Peleti yıkama başına 20 mililitre önceden soğutulmuş metanol kullanarak iki kez yıkayın. Daha sonra, supernatant aspire ve yeniden süspansiyon tampon dört mililitre protein pelet askıya.
Proteini yeniden süspansiyonu yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. 50 mikrolitre streptavidin boncukları PBS ile üç kez yıkayın. Yıkanmış boncukları proteinin yeniden süspansiyonuna ekleyin ve çözeltiyi 20 rpm dönüş hızında dikey bir rotatörde üç saat boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, burada gösterilen her yıkama tamponu ile sırayla boncukyı yıkayın. 20 mikrolitre PBS ile yıkanmış boncukları yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. 20 mikrolitre 2X protein yükleme tamponekleyin ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede tedavi.
Daha sonra protein örneklerini SDS-PAGE ile işleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi Coomassie Brilliant Blue ile lekeleyin. Bu çalışmada primer embriyonik NSPC'ler genişletilerek in vitro olarak metabolik olarak etiketlendi. Başarılı endotel ortak kültürü NSPC'leri büyük yaprak benzeri klonlar oluşturmaya yönlendirir.
Antikorlarla immünoleboyama, klonikte hücrelerin çoğunun Nestin pozitif NSPC'ler olduğunu, çok azının beta tubulin 3 pozitif nöronal hücreler olduğunu ortaya koymaktadır. Buna karşılık, non-kültür sisteminde oluşan klonlarda Nestin pozitif hücreleri ve beta tubulin 3 pozitif nöronal hücrelerin yüzdesi hemen hemen aynıdır. Kimyasal muhabir Ac4ManAz metabolik bir analog ve içsel protein sialylation yolu dahil edilebilir.
Birincil NSPC'ler için 100 mikromolar optimize edilmiş bir etiketleme konsantrasyonu kullanılır ve hücre ölümünün hücresel ve çekirdekmorfolojisi ile gösterilen kombinator değerlendirmesi, bu etiketleme konsantrasyonunun belirgin sitotoksik etkilere neden olmadığını ve NSPC'leri verimli bir şekilde etiketleyebildiğini göstermektedir. Endotel ortak kültür ve eş-kültür dışı sistemde NSPC'lerin klonal morfolojisi, kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli etkilenmez. Biotin konjugasyonu ve streptavidin boncuk arınması ile Ac4ManAz etiketli kültürden hazırlanan protein örnekleri, SDS-PAGE jellerinde güçlü Coomassie Brilliant Blue boyama sinyali göstermektedir.
Bu arada DMSO kontrol grubundan protein örnekleri ile yüklü şeritlerde sadece arka plan ve non-spesifik bağlayıcı sinyaller boyama vardı. Bu aynı zamanda Ac4ManAz tarafından NSPC'lerin etkin etiketleme gösterir. Bu protokol denendiğinde, biyosellüler reaksiyon için gerekli tüm çözümler taze olarak hazırlanmalı ve yetersiz reaksiyonu önlemek için reaksiyon süresi sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir.
Protokolümüz den sonra nöro kök hücre zenginleştirilmiş yüzey glikan yapısı analiz edilebilir. Nöral kök ve progenitor hücre zenginleştirilmiş yüzey proteinlerinin protokolümüz sadece belirteçleri yükselmekle kalmıyor, aynı zamanda yükseltilmiş desen saflaştırma stratejisi ve bu hücre popülasyonu için rijit sinyal devresi çizimi üzerinde de önemli işlevler oynamaktadır.
