As células neurais e progenitoras podem se auto-renovar e se diferenciar em diferentes tipos de células neurais, apoiando o desenvolvimento do sistema nervoso e oferecendo um recurso para medicina regenerativa. Essas células são heterogêneas, e precisamos conhecer seus marcadores de superfície celular específicos para obter populações celulares purificadas e entender suas funções. Nosso protocolo fornece uma técnica simples, sensível e eficiente para analisar proteínas de membrana de células-tronco neurais primárias e progenitoras, ajudando a identificar novos marcadores de superfície para essas células.
A principal vantagem do nosso protocolo é sua capacidade de analisar diretamente o proteome superficial das células neurais primárias e progenitoras com a sensibilidade e especificidade melhoradas. Isso é conseguido expandindo-os através da co-cultura dentro de células endoteliais in vitro e alta trato de células intrínsecas MAPK-ERK caminho para rotular porinas superficiais. Com as pró-modificações poros na expansão de células-tronco in vitro, nosso protocolo pode ser facilmente aplicado para identificar marcadores superficiais de outros tipos de células-tronco.
Para preparar as células endoteliais, suspenda-se uma pelota de célula BEN3 de uma placa de Petri de 10 centímetros a 90% de confluência com nove mililitros de meio celular BEN3. Adicione um mililitro da suspensão celular em uma inserção de suporte permeável. Adicione mais dois mililitros de médio BEN3 por poço na câmara inferior da matriz.
Continue a cultivar as células por um dia a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Um dia depois de emplacar as células nas pastilhas, aspire suavemente o meio, primeiro a partir da câmara inferior e depois das pastilhas. Lave a face das pastilhas três vezes com DMEM pré-aquecido.
Lave a superfície externa das pastilhas enxaguando com DMEM pré-aquecido. Em seguida, adicione um mililitro de AM pré-aquecido em uma única inserção. Transfira as pastilhas para os poços com células corticais primárias.
Incubar a cocultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas. Dissolver Ac4ManAz em DMSO para alcançar uma concentração de estoque de 200 mililitros. Recupere a placa de cocultura neural-endotelial da incubadora.
Adicione um microliter do estoque Ac4ManAz a cada câmara inferior e 0,5 microliters por inserção na cocultura. Cultura as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Enquanto as células estão criando adicionar 100 microliters de RM por inserção e 200 microliters de RM por câmara inferior para re-alimentar as células endoteliais e neurais a cada dois dias.
Primeiro remova as pastilhas das placas de cocultura e aspire o meio de cultura do fundo dos poços. Em seguida, lave as células neurais uma vez com PBS pré-aquecido. Aspire o PBS dos poços e adicione um mililitro de um pré-refrigerado 4% de deído em PBS para cada poço.
Conserte as células em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado. Aspire o PBS e adicione um mililitro de tampão conjugado de biotina recém-preparado 1 em cada poço.
Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, aspire o tampão de reação dos poços e lave as células três vezes com PBS. Adicione um mililitro de tampão de coloração a cada poço de células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, aspire o tampão de coloração dos poços e lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado. Adicione um mililitro de tampão de bloqueio a cada poço de células e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o tampão de bloqueio dos poços e adicione um mililitro da solução de anticorpos primários a cada poço.
Incubar as células durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos dos poços. Lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado.
Aspire o PBS dos poços e adicione um mililitro de anticorpo secundário a cada poço. Incubar as células em temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, aspire a solução dos poços e lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado.
Primeiro, prepare o complexo de sulfato cupérico BTTAA 2, tampão de re-suspensão de proteínas completa, tampão de lavagem de proteínas 1, tampão de lavagem de proteínas 2 e tampão de lavagem de proteínas 3, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, remova as pastilhas das placas de co-cultura. Aspire o meio de cultura dos poços inferiores e lave as células neurais uma vez com PBS pré-refrigerado.
Aspire o PBS e adicione 200 microliters de tampão RIPA pré-refrigerado a cada poço. Incubar as placas no gelo por cinco minutos e coletar a lise proteica em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar a 12.000 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar os detritos celulares.
Transfira o supernante para novos tubos de 1,5 mililitro e determine a concentração de proteínas com um kit BCA de acordo com as instruções dos fabricantes. Em seguida, ajuste a concentração de proteína para um miligrama por mililitro. Adicione 100 biotina de alquila micromolar, 2,5 milimonas de sódio ascorbate e 1XBTTAA complexo de sulfato cupric 2 a um mililitro de lise proteica.
Misture bem a solução e incuba-a à temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, transfira a solução de reação em 20 mililitros de metanol pré-resfriado em um tubo cônico de 50 mililitros. Misture bem e incubar durante a noite a menos 30 graus Celsius para precipitar as proteínas.
Centrifugar a 4500 vezes G e a 4 graus Celsius por 15 minutos para pelotar os precipitados da proteína. Lave a pelota duas vezes usando 20 mililitros de metanol pré-resfriado por lavagem. Em seguida, aspire o supernasciente e suspenda a pelota de proteína em quatro mililitros de tampão de re-suspensão.
Transfira a re-suspensão da proteína para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Lave 50 microliters de contas streptavidin três vezes com PBS. Adicione as contas lavadas à re-suspensão da proteína e incubar a solução a quatro graus Celsius por três horas em um rotador vertical a uma velocidade de rotação de 20 rpm.
Depois disso, lave as contas sequencialmente com cada tampão de lavagem mostrado aqui. Suspenda as contas lavadas com 20 microlitrais de PBS e transfira-as para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 20 microliters de tampão de carga de proteína 2X e trate a 95 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, processe as amostras de proteína com SDS-PAGE e manche-as com Coomassie Brilliant Blue, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, os NSPCs embrionários primários são expandidos e metabolicamente rotulados in vitro. Co-cultura endotelial bem sucedida leva os NSPCs a formar grandes clones semelhantes a folhas.
Imunostaining com anticorpos revela que no clone, a maioria das células são NSPCs positivos de Nestin, enquanto muito poucas são células neuronais beta tubulina 3 positivas. Em contraste, a porcentagem de células positivas nestin e beta tubulin 3 células neuronais positivas em clones formados em sistema não-co-cultura são quase as mesmas. O repórter químico Ac4ManAz é um analógico metabólico e pode ser incorporado na via de sialylation de proteínas intrínsecas.
Uma concentração otimizada de rotulagem de 100 micromolalares para NSPCs primários é usada e a avaliação combinatória da morte celular indicada pela morfologia celular e nuclei sugere que essa concentração de rotulagem não causa efeitos citotóxicos óbvios e é capaz de rotular insplicados eficientemente. A morfologia clonal, a autoconexão e o potencial de diferenciação dos NSPCs tanto na cocultura endotelial quanto no sistema não-cocultura não são afetados. Amostras de proteínas preparadas a partir da cultura rotulada Ac4ManAz por conjugação de biotina e purificação de contas streptavidin mostram forte sinal de coloração Coomassie Brilliant Blue em géis SDS-PAGE.
Enquanto isso, havia apenas o fundo de coloração e sinais de ligação não específicos nas pistas carregadas com amostras de proteínas do grupo controle DMSO. Isso também indica a rotulagem eficiente de NSPCs pelo Ac4ManAz. Ao tentar este protocolo, todas as soluções necessárias para a reação biocelular devem ser preparadas recentemente e o tempo de reação deve ser controlado firmemente para evitar uma reação insuficiente.
Seguindo nosso protocolo, a estrutura da célula neuro-tronco enriquecida glicano pode ser analisada. Nosso protocolo de tronco neural e células progenitoras enriqueceu proteínas superficiais não apenas marcadores de aumento, mas também desempenha funções importantes na estratégia de purificação de padrões elevados e na ilustração de circuitos de sinal rígido para esta população celular.
