使用35S标记的异氨酸和半胱氨酸的放射性脉冲追逐仍然是研究活细胞中蛋白质生物合成的唯一生化方法。蛋白质生物合成包括翻译、折叠和组装以及贩运和降解。将放射性脉冲追逐与翻译后蛋白质修饰分析相结合，如二硫化键的形成和乙酰化，为研究蛋白质的用信念提供了一种敏感而定量的检测方法。
此过程需要良好的焦点和实验处理。良好的准备至关重要，如缓冲器、放射性工作空间和明确的时间表。本视频清晰地查看了放射性脉冲追逐协议。
演示该程序的将是来自我们实验室的pHd候选人杨慧英。要开始此过程，种子转染和培养细胞如文本协议中所述。在脉搏追逐之前，通过显微镜检查您的细胞。
接下来，用两毫升的洗涤缓冲液洗碗。和两毫升的饥饿中培养的细胞，并放置在一个加湿的孵化器在37摄氏度与5%的二氧化碳15分钟。确保脉冲追逐设置有序。
将盘子转移到水浴的架子上，预热至 37 摄氏度。确保盘子与水接触，但请勿漂浮。然后，启动一个计时器。
在40秒，吸饥饿介质。使用微移液器，绘制600微升脉冲溶液。在一分钟内，轻轻地将脉冲溶液添加到菜的中心。
重复此过程，以一分钟间隔删除饥饿介质并添加剩余菜盘的脉冲溶液。在正好11分钟和所有以下菜肴，根据脉搏追逐方案，除了零分钟追逐样品，添加两毫升的追逐介质直接到菜。吸进追逐介质，代之以两毫升的新鲜追逐介质。
每隔一分钟对所有剩余菜肴重复此过程。当计时器读取正好 16 分钟时，将两个追逐介质直接添加到脉冲介质顶部的零分钟追逐盘上，以停止标记。立即吸气介质。
将盘子转移到冷却的铝板中，并加入两个冷止缓冲器。将所有其他菜肴转移到摄氏37度的孵化器。在每个追逐时间结束前两分钟，将每个追逐盘从孵化器转移到水浴。
在每道菜的准确追逐时间，吸进追逐介质，将菜转移到冷却的铝板中。添加两毫升的冰冷停止缓冲液。将所有盘子放在冰上，停止缓冲，直到有时间将细胞融化。
然后吸走止损溶液并洗洗所有盘子。三同时用两毫升的冰冷停止溶液。完全吸制止损液，一次向两个盘子中加入 600 微升的解液缓冲液。
使用细胞刮刀，彻底刮擦盘子的表面，但轻轻地混合了落酸。将每道菜的利沙酸盐转移到新鲜 1.5 毫升微离心管中。在摄氏4度下在15，000至20，000G下离心10分钟，以对核进行分粒。
对于悬浮细胞的脉冲追逐收集500万细胞每个时间点在一个50毫升管。执行文本中描述的饥饿过程。在水浴中进行饥饿程序 15 分钟后，启动计时器。
在一分钟内，将275个未稀释标签的微库直接添加到含有细胞的管子中，并旋转混合。在正好 11 分钟，添加四毫升的追逐介质，以停止标签。并立即将一毫升转移到冰面上含有 9 毫升冰冷停止溶液的 15 毫升管中，以停止贴标签。
重复这个过程，将一毫升的追逐转移到冰上的管子上，每个连续的追逐时间点都含有九毫升的停止溶液。免疫沉淀后，吸气完全洗涤。将珠子重新悬浮在 TE 缓冲液和涡流中的 20 微升中。
添加两个 X 样品缓冲液的 20 微升，无需还原剂。漩涡样品，然后在95摄氏度加热5分钟。再次旋转样品。
在室温下以12，000倍G离心1分钟。将 19 微升非减量上流液转移到含有 500 毫摩尔滴滴涕微升的新鲜微离心管中。如果需要，请快速离心样品，使所有液体都位于底部。
在95摄氏度下加热5分钟。让减少的样品冷却，然后涡流。在室温下将减少的样品和非减少的样品在12，000倍G下离心一分钟，然后在所有样品中加入1.1微升的一摩尔NEM。
本研究中，采用放射性脉冲追逐法分析完整细胞中的蛋白质折叠和传输。此处显示了 HIV 的折叠和分泌一个 GP120 来自粘附脉冲追逐。非还原凝胶显示GP120的氧化折叠。
紧接着脉冲标记，它显示为一个漫射带在凝胶中更高。随着追逐的进展，带通过更漫反射的折叠中间体向下迁移凝胶，直到它积聚在代表GP120本机折叠的紧密带中。当二硫化键的形成增加蛋白质的紧凑性，导致其迁移速度比完全减少的蛋白质快时，就发生了这种情况。
在还原凝胶上，二硫化物键和所有分子都减少了，并且不影响生物。因此，移动性的差异只是分子质量变化的结果。随着时间的推移，从减少的信号肽未洁形式到减少的信号肽切裂形式的变化代表了GP120的翻译后信号肽裂解。
由于信号肽的丢失，随着更多蛋白质达到原生褶皱并失去信号肽，信号肽的丧失，流动性增加。在非还原凝胶和还原凝胶上，由于 GP120 的分泌，信号从大约一小时后开始下降。这可以通过分析媒体来监视。
该方法适用于任何细胞系，包括器官细胞模型。但成功在很大程度上取决于感兴趣的蛋白质的表达水平。在开始此过程之前，请标记您的菜肴，并在整个实验中保持此顺序。
在添加饥饿介质之前，请确保一切已准备就绪。这是实验的开始。你的实验室时间是你的朋友，但是当你没有准备好的时候，你可能是最大的敌人。
比尔的追逐可以与有限的蛋白质解相结合，以随着时间的推移调查蛋白质的全部遗产。此外，不同的选择冰柜方法将允许分析冲洗或严格化或充电差异。为了保护研究人员和设备，必须遵守所有局部辐射安全规则。
应根据协议采取保护措施。请注意，用于 STH 页面的丙烯酰胺是神经毒性。
