L'inseguimento di impulsi radioattivi utilizzando 35 methionine e cisteina etichettate con S è ancora l'unico modo biochimico per studiare la biosintesi proteica con il tempo nelle cellule vive. La biosintesi proteica copre sia la traduzione, la piegatura e l'assemblaggio, sia il traffico e il degrado. Combinare l'inseguimento dell'impulso radioattivo con l'analisi delle modifiche delle proteine co-e post-traslazione, come la formazione del legame disolfuro e l'acetilazione fornisce un saggio sensibile e quantitativo per indagare la fede della proteina con il tempo.
Per questa procedura è necessaria una buona messa a fuoco e una manipolazione sperimentale. Una buona preparazione è fondamentale, come i buffer, lo spazio di lavoro radioattivo e una pianificazione chiara. Questo video fornisce una visione chiara sopra la spalla del protocollo di inseguimento a impulsi radioattivi.
A dimostrare la procedura sarà Hui Ying Yeoh, un candidato pHd del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, seed transfect e cellule di coltura come delineato nel protocollo di testo. Prima dell'inseguimento a impulsi, ispezionare le cellule attraverso il microscopio.
Quindi, lavare i piatti con due millilitri di tampone di lavaggio. E due millilitri di mezzo di fame per le cellule e mettere i piatti in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 15 minuti. Assicurati che la tua configurazione di inseguimento a impulsi sia in ordine.
Trasferire i piatti alle rastrelliere nel bagno d'acqua, preri warmed a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che i piatti siano a contatto con l'acqua, ma non galleggiare. Quindi, avvia un timer.
A 40 secondi, aspirare il mezzo di fame. Utilizzando un micro pipet, disegnare 600 microlitri di soluzione di impulso. Esattamente un minuto, aggiungere delicatamente la soluzione di impulso al centro del piatto.
Ripetere questo processo di rimozione del mezzo di fame e aggiungere la soluzione di impulso per i piatti rimanenti a intervalli di un minuto. Esattamente a 11 minuti e per tutti i piatti successivi, secondo lo schema di inseguimento a impulsi, ad eccezione del campione di inseguimento di zero minuti, aggiungere due millilitri di mezzo di inseguimento direttamente al piatto. Aspirare il mezzo di inseguimento e sostituirlo con due millilitri di mezzo di inseguimento fresco.
Ripetere questo processo per tutti i piatti rimanenti a intervalli di un minuto. Quando il timer legge esattamente 16 minuti, aggiungi due militer di mezzo di inseguimento direttamente al piatto di inseguimento di zero minuti, sopra il mezzo di impulso, per interrompere l'etichettatura. Aspirare immediatamente il mezzo.
Trasferire il piatto su una piastra di alluminio raffreddata e aggiungere due militers di tampone di arresto freddo ghiaccio. Trasferisci tutti gli altri piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Trasferisci ogni piatto di inseguimento dall'incubatrice al bagno d'acqua due minuti prima della fine di ogni tempo di inseguimento.
All'esatto tempo di inseguimento per ogni piatto, aspira il mezzo di inseguimento e trasferisci il piatto su una piastra di alluminio raffreddata. Aggiungere due millilitri di tampone di arresto freddo ghiaccio. Lasciare tutti i piatti sul ghiaccio e fermare il buffer fino a quando non c'è tempo per lelizzare le cellule.
Quindi aspirare la soluzione di arresto e lavare tutti i piatti. Tre contemporaneamente con due millilitri di soluzione di arresto del freddo ghiacciato. Aspirare completamente la soluzione di arresto e aggiungere 600 microlitri di tampone di lysis a due piatti alla volta.
Utilizzando un raschietto per celle, raschiare accuratamente la superficie del piatto, ma delicatamente per mescolare il lisato. Trasferire il lysate da ogni piatto a un tubo di micro centrifuga fresco da 1,5 millilitri. Centrifuga a 15.000-20.000 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare i nuclei.
Per l'inseguimento a impulsi sulle celle di sospensione raccolta cinque milioni di celle per punto di tempo in un tubo da 50 millilitri. Eseguire la procedura di fame come descritto nel testo. Dopo la procedura di fame nel bagno d'acqua per 15 minuti, avviare il timer.
Esattamente in un minuto, aggiungere 275 microcuries di etichetta non diluita direttamente al tubo contenente celle e ruotare per mescolare. Esattamente a 11 minuti, aggiungi quattro millilitri di mezzi di inseguimento per fermare l'etichettatura. E trasferire immediatamente un millilitro in un tubo da 15 millilitri su ghiaccio che contiene nove millilitri di soluzione di arresto freddo del ghiaccio per interrompere l'etichettatura.
Ripetere questo processo di trasferimento di un millilitro di inseguimento in un tubo su ghiaccio contenente nove millilitri di soluzione di arresto per ogni successivo punto di inseguimento. Dopo l'immunoprecipitazione, aspirare completamente l'ultimo lavaggio. Sospendere di nuovo le perline in 20 microlitri di tampone e vortice TE.
Aggiungere 20 microlitri di due X tampone campione senza l'agente riducente. Vortice i campioni e poi scaldarli a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Vortice i campioni di nuovo.
Centrifuga a 12.000 volte G a temperatura ambiente per un minuto. Trasferire 19 microlitri del supernatante non ridotto in un tubo di microcentrifugo fresco che contiene un microlitro di DDT da 500 millimolare. Se necessario, centrifugare rapidamente il campione in modo che tutti i liquidi si trovano nella parte inferiore.
E riscaldare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Lasciare raffreddare il campione ridotto e quindi vortice. Centrifugare entrambi i campioni ridotti e non ridotti a 12.000 volte G a temperatura ambiente per un minuto, quindi aggiungere 1,1 microlitri di un NEM molare a tutti i campioni.
In questo studio, un approccio di inseguimento di impulsi radioattivi viene utilizzato per analizzare il ripiegamento delle proteine e il trasporto in cellule intatte. La piegatura e la secrezione dell'HIV un GP120 da un inseguimento a impulsi aderenti è mostrato qui. Il gel non riducente mostra la piegatura ossidativa di GP120.
Immediatamente dopo l'etichettatura degli impulsi, appare come una banda diffusa più in alto nel gel. Man mano che l'inseguimento procede, la banda migra lungo il gel attraverso intermedi pieghevoli ancora più diffusi fino ad accumularsi nella banda stretta che rappresenta nativamente piegata alla GP120. Ciò si verifica quando la formazione di legami disolfuro aumenta la compattezza della proteina, facendola migrare più velocemente della proteina completamente ridotta.
Sul gel riducente, i legami disolfuro e tutte le molecole sono stati ridotti e non influenzano la mobiilty. Come tale, le differenze nella mobilità sono solo il risultato di cambiamenti nella massa molecolare. Lo spostamento nel tempo dalla forma ridotta del peptide peptidico del segnale alla forma ridotta di scissione del peptide del segnale rappresenta la scissione peptidica del segnale post-traslazione di GP120.
La mobilità aumenta a causa della perdita del peptide del segnale che aumenta durante l'inseguimento man mano che più proteine raggiungono la piega nativa e perdono il loro peptide di segnale. Sia sul gel non riducente che su quello riducente, il segnale inizia a diminuire da circa un'ora in poi a causa della secrezione di GP120. Questo può essere monitorato analizzando i media.
Questo metodo è applicabile a qualsiasi linea cellulare, inclusi i modelli di cellule organoidi. Ma il successo dipende molto dal livello di espressione della proteina di interesse. Prima di iniziare questa procedura, contrassegnare i piatti e mantenere questo ordine per tutto l'esperimento.
Assicurati che tutto sia preparato prima di aggiungere il mezzo di fame. Questo è l'inizio dell'esperimento. E il tuo tempo di laboratorio è tuo amico, ma può essere il tuo più grande nemico quando non sei preparato.
L'inseguimento di Bill può essere combinato con una proteolisi limitata per indagare l'intera tenuta di proteine con il tempo. Inoltre, diversi metodi di congelatore eletti consentiranno l'analisi del risciacquo o del rigormorizzazione o delle differenze di carica. Per proteggere il ricercatore e l'apparato, tutte le norme locali sulla sicurezza delle radiazioni devono essere rispettate.
E le misure di protezione dovrebbero essere prese secondo il protocollo. Si noti che l'acrilammide, utilizzata per la pagina STH, è neurotossica.
