Радиоактивная пульсовая погоня с использованием 35 S-маркированного метионина и цистеина по-прежнему является единственным биохимическим методом исследования биосинтеза белка со временем в живых клетках. Биосинтез белка охватывает как перевод, складывание и сборку, так и торговлю и деградацию. Сочетание радиоактивного пульса погони с анализом совместного и после перевода белковых модификаций, таких как образование дисульфидных связей и ацетилирование обеспечивает чувствительный и количественный анализ для исследования веры белка со временем.
Для этой процедуры требуется хорошая фокусировка и экспериментальная обработка. Хорошая подготовка имеет решающее значение, как буферы, ваше радиоактивное рабочее пространство, и четкий график. Это видео обеспечивает четкое представление через плечо радиоактивного протокола погони импульса.
Демонстрация процедуры будет Хуэй Инг Yeoh, pHd кандидата из нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, семена трансфект и культуры клеток, как указано в текстовом протоколе. Перед пульсом погони, проверить ваши клетки через микроскоп.
Затем мыть посуду с двумя миллилитров мыть буфера. И два миллилитров голодания среднего к клеткам и поместите посуду во влажный инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 15 минут. Убедитесь, что ваш пульс погони создан в порядке.
Перенесите посуду на стеллажи на водяной бане, предварительно разогретой до 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что блюда находятся в контакте с водой, но не плавать. Затем запустите таймер.
На 40 секунд, аспирировать голодание среды. Используя микро трубу, нарисуйте 600 микролитров импульсного раствора. Ровно в одну минуту аккуратно добавьте импульсный раствор в центр блюда.
Повторите этот процесс удаления голодающей среды и добавления импульсного раствора для остальных блюд с интервалом в одну минуту. Ровно в 11 минут и для всех следующих блюд, в соответствии с схемой пульс погони, за исключением нулевой минуты погони образца, добавить два миллилитров погони среды непосредственно к блюду. Аспирировать погони среды и заменить его на два миллилитров свежей погони среды.
Повторите этот процесс для всех оставшихся блюд с интервалом в одну минуту. Когда таймер читает ровно 16 минут, добавить два militers погони среды непосредственно к нулю минуту погони блюдо, в верхней части импульса среды, чтобы остановить маркировки. Немедленно аспирировать среду.
Перенесите блюдо на охлажденной алюминиевой пластины и добавить два militers ледяной остановки буфера. Перенесите все остальные блюда в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. Перенесите каждое блюдо погони обратно из инкубатора на водяную баню за две минуты до конца каждого времени погони.
В точное время погони за каждым блюдом, аспирировать погони среды и передачи блюдо на охлажденной алюминиевой пластины. Добавьте два миллилитров буфера остановки ледяного холода. Оставьте все блюда на льду и остановите буфер до тех пор, пока не будет времени, чтобы подысать клетки.
Затем аспирировать стоп-раствор и вымыть все блюда. Три одновременно с двумя миллилитров ледяной остановки раствора. Аспирировать стоп-раствор полностью и добавить 600 микролитров буфера лиза к двум блюдам одновременно.
Используя клеточный скребок, тщательно соскреблите поверхность блюда, но аккуратно перемешайте лисат. Передача лизата с каждого блюда в свежую 1,5 миллилитровую микро центрифугу трубки. Центрифуга при 15 000-20 000 Г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут гранулировать ядра.
Для пульса погони на суспензии клетки сбора пять миллионов клеток за время точки в одной 50 миллилитровой трубки. Выполните процедуру голодания, как описано в тексте. После процедуры голодания в водяной бане в течение 15 минут, запустите таймер.
Ровно в одну минуту добавьте 275 микрокурий неразбавленной этикетки непосредственно в трубку, содержащую клетки, и вихрем, чтобы перемешать. Ровно через 11 минут добавьте четыре миллилитров средств погони, чтобы остановить маркировку. И немедленно перенесите один миллилитр в 15 миллилитровую трубку на льду, которая содержит девять миллилитров раствора ледяной остановки, чтобы остановить маркировку.
Повторите этот процесс передачи одного миллилитров погони в трубку на льду, содержащую девять миллилитров стоп-раствора для каждой последующей точки времени погони. После иммунопреципиентации, аспирировать последнюю стирку полностью. Повторно приостанавливать бисер в 20 микролитров буфера TE и вихря.
Добавьте 20 микролитров двух буферов образца X без уменьшаемого агента. Vortex образцы, а затем нагреть их при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Вихрь образцы снова.
Центрифуга при температуре 12 000 Г при комнатной температуре в течение одной минуты. Перенесите 19 микролитров несоеленного супернатанта в свежую микроцентрифугную трубку, которая содержит один микролитр 500 миллимолярный ДДТ. При необходимости центрифуга образца быстро, так что все жидкости находятся на дне.
И тепла при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Пусть уменьшенный образец остынет, а затем вихрь. Центрифуга как уменьшенных, так и неразмещенных образцов в 12 000 раз G при комнатной температуре в течение одной минуты, а затем добавить 1,1 микролитров одного молара NEM для всех образцов.
В этом исследовании, радиоактивный импульс погони подход используется для анализа белка складывания и транспортировки в нетронутых клетках. Складной и секреции ВИЧ один GP120 от адепта пульс погони показано здесь. Не уменьшающийся гель показывает окислительное складывание GP120.
Сразу же после маркировки пульса, он появляется как диффузная полоса выше в геле. По мере того как погоня прогрессирует, полоса мигрирует вниз с геля через даже более диффузные складывая промежуточные до тех пор пока она не аккумулирует в плотной полосе которая представляет родно сложенный на GP120. Это происходит по мере того, как образование дисульфидных связей повышает компактность белка, заставляя его мигрировать быстрее, чем полностью уменьшенный белок.
На уменьшая гель, связи disulfide и все молекулы были уменьшены и не влияют на mobiilty. Таким образом, различия в подвижности являются лишь результатом изменений молекулярной массы. Сдвиг с течением времени от уменьшенного сигнала пептида нечистой форме к уменьшенной форме пептида сигнала расщепляется представляет собой пост-трансляционный сигнал пептидного расщепления GP120.
Мобильность увеличивается из-за потери пептида сигнала, который увеличивается во время погони, как больше белков достичь родной раз и теряют свой сигнал пептида. Как на не уменьшаемый, так и на уменьшаемый гель, сигнал начинает уменьшаться примерно с одного часа из-за секреции GP120. Это можно контролировать путем анализа средств массовой информации.
Этот метод применим к любой клеточной линии, включая органоидные клеточные модели. Но успех во многом зависит от уровня экспрессии белка интереса. Перед началом этой процедуры отметите посуду и держите этот порядок на протяжении всего эксперимента.
Убедитесь, что все подготовлено перед добавлением голодания среды. Это начало эксперимента. И ваше лабораторное время ваш друг, но может быть вашим самым большим врагом, когда вы не готовы.
Погоня Билла может быть объединена с ограниченным протеолиза, чтобы исследовать полное имущество белков со временем. Кроме того, различные выборные методы морозильных камер позволит анализ полоскания или строгости или заряда различия. Для защиты исследователя и аппарата необходимо соблюдать все местные правила радиационной безопасности.
И защитные меры должны быть приняты в соответствии с протоколом. Обратите внимание, что ваш акриламид, используемый для вашей страницы STH является нейротоксическим.
