La chasse aux impulsions radioactives à l’aide de 35 méthionine et cystéine étiquetées S est toujours la seule méthode biochimique pour étudier la biosynthèse protéique avec le temps dans les cellules vivantes. La biosynthèse protéique couvre à la fois la traduction, le pliage et l’assemblage, ainsi que le trafic et la dégradation. La combinaison de la chasse aux impulsions radioactives avec l’analyse des modifications des protéines co-et post-traduction, telles que la formation de liaisons de disulfide et l’acétylation fournit un essai sensible et quantitatif pour étudier la foi de la protéine avec le temps.
Une bonne concentration et une manipulation expérimentale sont nécessaires pour cette procédure. Une bonne préparation est cruciale, comme les tampons, votre espace de travail radioactif et un calendrier clair. Cette vidéo fournit une vue claire sur l’épaule du protocole radioactif de chasse aux impulsions.
La démonstration de la procédure sera Hui Ying Yeoh, un candidat pHd de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, les cellules transfect et de culture des semences telles qu’décrites dans le protocole textuel. Avant la chasse aux impulsions, inspectez vos cellules au microscope.
Ensuite, lavez la vaisselle avec deux millilitres de tampon de lavage. Et deux millilitres de moyenne de famine aux cellules et placer les plats dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Assurez-vous que votre chasse au pouls mise en place est en ordre.
Transférer la vaisselle sur les grilles du bain d’eau, préchauffé à 37 degrés Celsius. Assurez-vous que la vaisselle est en contact avec l’eau, mais ne flottez pas. Ensuite, démarrez une insurrateur.
À 40 secondes, aspirer le milieu de famine. À l’aide d’un micro pipet, dessinez 600 microlitres de solution d’impulsion. À exactement une minute, ajouter délicatement la solution d’impulsion au centre du plat.
Répétez ce processus d’élimination du milieu de famine et d’ajout de la solution d’impulsion pour les plats restants à intervalles d’une minute. À exactement 11 minutes et pour tous les plats suivants, selon le schéma de chasse au pouls, à l’exception de l’échantillon de chasse de zéro minute, ajouter deux millilitres de milieu de chasse directement au plat. Aspirez le milieu de chasse et remplacez-le par deux millilitres de milieu de chasse frais.
Répétez ce processus pour tous les plats restants à intervalles d’une minute. Lorsque la minuterie lit exactement 16 minutes, ajouter deux militers de milieu de chasse directement au plat de chasse de zéro minute, sur le dessus du support d’impulsion, pour arrêter l’étiquetage. Aspirez immédiatement le milieu.
Transférer le plat dans une plaque d’aluminium refroidi et ajouter deux militers de tampon d’arrêt froid de glace. Transférer tous les autres plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Transférer chaque plat de chasse de l’incubateur au bain d’eau deux minutes avant la fin de chaque temps de chasse.
À l’heure exacte de la chasse pour chaque plat, aspirer le milieu de chasse et transférer le plat dans une plaque d’aluminium refroidi. Ajouter deux millilitres de tampon d’arrêt froid de glace. Laissez tous les plats sur la glace et arrêtez le tampon jusqu’à ce qu’il y ait le temps de lyse les cellules.
Ensuite, aspirez la solution d’arrêt et lavez toute la vaisselle. Trois en même temps avec deux millilitres de solution d’arrêt froid de glace. Aspirez complètement la solution d’arrêt et ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse à deux plats à la fois.
À l’aide d’un grattoir cellulaire, racler la surface du plat à fond, mais doucement pour mélanger le lysate. Transférer le lysate de chaque plat dans un tube de micro centrifugeuse frais de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 15 000 à 20 000 G à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter les noyaux.
Pour la chasse aux impulsions sur les cellules de suspension, collectez cinq millions de cellules par point de temps dans un tube de 50 millilitres. Effectuez la procédure de famine telle que décrite dans le texte. Après la procédure de famine dans le bain d’eau pendant 15 minutes, démarrez la minuterie.
À exactement une minute, ajouter 275 microcuries d’étiquette non diluée directement au tube contenant des cellules et tourbillonner pour mélanger. À exactement 11 minutes, ajouter quatre millilitres de supports de chasse pour arrêter l’étiquetage. Et transférez immédiatement un millilitre dans un tube de 15 millilitres sur la glace qui contient neuf millilitres de solution d’arrêt froid de glace pour arrêter l’étiquetage.
Répétez ce processus de transfert d’un millilitre de poursuite à un tube sur glace contenant neuf millilitres de solution d’arrêt pour chaque point de temps de poursuite successif. Après l’immunoprécipice, aspirer complètement le dernier lavage. Suspendre à nouveau les perles dans 20 microlitres de tampon TE et vortex.
Ajouter 20 microlitres de deux tampons d’échantillon X sans l’agent réducteur. Vortex les échantillons, puis les chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vortex les échantillons à nouveau.
Centrifugeuse à 12 000 fois G à température ambiante pendant une minute. Transférer 19 microlitres du supernatant non réduit dans un tube de microcentrifugeuse frais qui contient un microlitre de 500 millimolaires DDT. Si nécessaire, centrifugez l’échantillon rapidement afin que tous les liquides soient au fond.
Et chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laisser refroidir l’échantillon réduit, puis vortex. Centrifugeuse les échantillons réduits et non réduits à 12 000 fois G à température ambiante pendant une minute, puis ajouter 1,1 microlitre d’un NEM molaire à tous les échantillons.
Dans cette étude, une approche radioactive de chasse aux impulsions est utilisée pour analyser le pliage et le transport des protéines dans les cellules intactes. Le pliage et la sécrétion du VIH un GP120 d’une chasse aux impulsions adhérente est montré ici. Le gel non réductur montre le pliage oxydatif du GP120.
Immédiatement après l’étiquetage des impulsions, il apparaît comme une bande diffuse plus élevée dans le gel. Au fur et à mesure que la poursuite progresse, la bande migre vers le bas du gel à travers des intermédiaires pliants encore plus diffus jusqu’à ce qu’il s’accumule dans la bande serrée qui représente nativement plié à GP120. Cela se produit lorsque la formation de liaisons de disulfide augmente la compacité de la protéine, ce qui la fait migrer plus rapidement que la protéine entièrement réduite.
Sur le gel réducteur, les liaisons de disulfide et toutes les molécules ont été réduites et n’affectent pas la mobiilité. En tant que tel, les différences de mobilité ne sont que le résultat de changements dans la masse moléculaire. Le passage au fil du temps de la forme réduite du peptide de signal uncleaved à la forme fendée réduite de peptide de signal représente le clivage peptidique de signal post-translationnel de GP120.
La mobilité augmente en raison de la perte du peptide de signal qui augmente pendant la chasse que plus de protéines atteignent le pli indigène et perdent leur peptide de signal. Tant sur le gel non réductible que sur le gel réductur, le signal commence à diminuer d’environ une heure en raison de la sécrétion de GP120. Cela peut être surveillé en analysant les médias.
Cette méthode s’applique à toute lignée cellulaire, y compris les modèles de cellules organoïdes. Mais le succès dépend grandement du niveau d’expression de la protéine d’intérêt. Avant de commencer cette procédure, marquez vos plats et gardez cet ordre tout au long de l’expérience.
Assurez-vous que tout est préparé avant d’ajouter le milieu de famine. C’est le début de l’expérience. Et votre temps de laboratoire est votre ami, mais peut être votre plus grand ennemi quand vous n’êtes pas préparé.
La chasse de Bill peut être combinée avec une protéolyse limitée pour étudier la succession complète des protéines avec le temps. De plus, différentes méthodes de congélation élues permettront d’analyser les différences de rinçage ou de rigormorisation ou de charge. Pour protéger le chercheur et l’appareil, toutes les règles locales de radioprotentité doivent être respectées.
Et les mesures de protection doivent être prises conformément au protocole. Notez que votre acrylamide, utilisé pour votre page STH est neurotoxique.
