人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径

该程序的总体目标是提供一种评估人类外周血内源性LRRK2激酶活性的方法。这是通过监测LRRK2中基的拉布蛋白磷酸化，使用Michael J.Fox基金会磷特异性拉布单克隆抗体实现的。在这里，我们专注于人类周围血嗜中性粒细胞作为同源位点种群的构成，具有高表达水平的Rab2和Rab10。

嗜中性粒细胞分离是基于一个负选择，在完成操作后40分钟内允许分离99%的纯和可行的嗜中性粒细胞，同时产生大量的蛋白质水平。将10毫升血液收集到血液收集管中。通过反转管轻轻混合七到八次。

将10毫升血液转移到50毫升锥形管中。加入血液100微升EDTA库存溶液1，0.1摩尔EDTAPBS溶液，轻轻混合。将 500 微升隔离鸡尾酒添加到整个血液样本中，每毫升从嗜中性粒细胞分离试剂盒中加入 50 微升。

在使用前30秒从嗜中性粒细胞隔离套件中旋转磁珠，以重新悬浮非常精细的磁珠。将 500 微升磁珠加入血液样本中，通过多次反转管轻轻混合。在室温下孵育五分钟。

使用 EDTA 库存溶液 2 将管顶到 50 毫升。这是一毫摩尔EDTAPBS解决方案。通过非常轻轻地上下移液两到三次混合。

将管子放入磁铁中，取下盖子，以避免随后的管子搅拌。在室温下孵育10分钟。小心移液器富集细胞悬浮液，含有嗜中性粒细胞，放入新的50毫升锥形管中。

不要触摸与磁铁接触的管子的一侧，避免收集和扰动管底的红血球。将大约 10 毫升的红血球悬浮液留在管底。漩涡磁珠使用前30秒，并加入0.5毫升磁珠到含有富集的中性粒细胞的管子。

通过倒置管子轻轻混合。在室温下孵育五分钟。将管子放入磁铁中，并取下盖子，以避免随后的搅拌。

在室温下孵育五分钟。小心移液的富集细胞悬浮液，该悬浮液中含有嗜中性粒细胞，在一个新的50毫升锥形管中。请勿触摸与磁铁接触的管的侧面。

将悬浮液在大约五毫升的悬浮液留在管子底部。为确保从细胞混合物中完全去除磁珠，将含有富集细胞的管放入磁铁中。在室温下孵育10分钟。

小心移液浓缩细胞悬浮液，现在含有纯中性粒细胞到一个新的50毫升锥形管。请勿触摸与磁铁接触的管的侧面。将悬浮液留在管底约五毫升。

用一毫升EDTA库存溶液2为独立细胞，最终体积约为41毫升。移液向上和向下混合。将溶液平均分成两根管，每个管中大约有20毫升。

在335G下将两个管离心5分钟。在离心步骤中，将MLi-2抑制剂库存、200微摩尔从零下80度冰柜中去除1000倍浓度，留在室温下供后续使用。离心步骤后立即，无需搅拌管，立即从上经剂中倒出，而不会干扰嗜中性粒。

在室温下，通过轻轻移液细胞上下四次，将每个细胞颗粒重新在10毫升的细胞培养培养中。标记一个管 DMSO 和另一个管 MLi-2。给DMSO贴标签的管子添加10微升的DMSO，并加入10微升200微摩尔MLi-2库存溶液，通过轻轻上下移液混合。

在室温下孵育样品30分钟。在孵育期间，每10分钟通过反转轻轻混合一次。在 30 分钟的 LRRK2 激酶抑制剂治疗中，从负 80 度冰柜中取出 0.5 摩尔 DIFP 库存溶液，并放在冰面上的烟罩中。

然后，将每毫升微囊素-LR库存溶液从负80度冰柜中移出，放在室温下解冻。从冰柜中取出0.25毫升的液，除去一个等分液，允许在室温下解冻，然后放在冰上供以后使用。准备一毫升含有一微升的DMSO的RPMI介质，称之为DMSO再增缓冲液。

准备一毫升含有200微摩尔MLi-2或替代LRRK2激酶抑制剂的RPMI介质，并称之为MLi-2再增缓冲液。经过30分钟的孵育期，两个管子在335G下离心5分钟，一如前。小心丢弃每个管中的上那液，而不干扰嗜中性粒。

对于 DMSO 标记管，轻轻将颗粒重新在一毫升 DMSO 再增缓冲液中。对于 MLi-2 标记管，在一毫升 MLi-2 再增缓冲液中重新分配颗粒。将重新冷凝的细胞颗粒转移到标有 DMSO 和 MLi-2 的相应离心管，并在 335G 下将两个管离心三分钟。

在离心步骤中，准备解解缓冲液。在烟罩中，小心地将0.25微升0.5摩尔DIFP溶液，以及0.25微升每毫升微细胞素-LR0.25微升到0.25毫升解液缓冲液中。混合并留在冰上，直到使用。

离心后立即用移液器小心彻底去除所有上流液，而不干扰嗜中性粒，将管子放在冰上。立即向每个管中加入100微升含有DIFP和微囊素-LR的解液缓冲液。使用 100 到 200 微升移液器，通过上下移液约 5 到 10 次重新暂停细胞颗粒。

将细胞放在冰上10分钟。然后，离心管在2万次G下，在4摄氏度下15分钟，以清除细胞碎片。将含有嗜中性粒细胞的DMSO和MLi-2上流液质转化为新的离心管。

丢弃碎屑颗粒。中性粒细胞酸盐现已准备就绪，可以冷冻在液氮中，储存在零下80度，以供将来分析。使用公开进口数据库的数据，此图显示，LRRK2 和 Rab10 蛋白质的丰度在人类外周血中性粒细胞和单核细胞中特别高。

通过这个程序隔离人类外周血嗜中性粒细胞，导致细胞的高不纯产量。顶部的表格显示了从三个健康献血者10毫升外周血中分离出的细胞总数。还显示分离细胞的纯度和生存能力，以及总蛋白酸盐产量。

治疗后，有和没有LRRK2激酶抑制剂，MLi-2，嗜中性粒细胞在强大的蛋白酶抑制剂DIFP的存在。对于左侧图 B，每通道10微克全细胞提取物接受多路复用定量免疫布洛特分析，并采用指示的抗体。右侧的数字 C 显示了 DIFP 对预防蛋白解酶降解的重要性，特别是大型 LRRK2 蛋白质的重要性。

相比之下，仅高浓度的PMSF就不那么有效。这里显示，LRRK2控制的Rab10磷酸化显著增加约三倍的外周血嗜中性粒细胞从遗传性帕金森病患者，怀有异质性VPS35 D620N突变相比，对照。上图显示了多路复用免疫布洛特分析及其底部的定量。

这表明VPS35 D620N突变通过一种未知机制激活LRRK2激酶活动路径。总之，我们提出了一个简单而可靠的检测方法，通过监测Rab蛋白磷酸化（如Rab10）在人类外周衍生的嗜中性粒细胞中测量LRRK2激酶通路活性，此方法使我们能够评估LRRK2通路活性，并确定突变、疾病状态或抑制剂如何调节LRRK2通路活性。