המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה להערכת פעילות קינאז LRRK2 אנדוגני בדם היקפי אנושי. זה מושגת על ידי ניטור LRRK2 מתווך זרחון של חלבונים Rab, העסקת מייקל J.Fox קרן פוספו ספציפי נוגדנים חד שבטיים כלבת. כאן אנו מתמקדים בניטרופילים של דם היקפי אנושי כקבוצה של אוכלוסיית אתר הומוגנית עם רמות ביטוי גבוהות הן של Rab2 והן של Rab10.
בידוד הנויטרופילים מבוסס על בחירה שלילית שבתוך 40 דקות מיום סיום הפעולה מאפשרת בידוד של 99% נויטרופילים טהורים ובת קיימא וגם מניבה כמות גבוהה של רמות חלבון. לאסוף 10 מיליליטר של דם לתוך צינור איסוף דם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך צינורות שבע עד שמונה פעמים.
להעביר 10 מיליליטר של דם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. הוסף לדם 100 microliters של פתרון מלאי EDTA 1, 0.1 פתרון EDTA PBS טוחן, לערבב בעדינות. הוסיפו 500 מיקרוליטרים לקוקטייל בידוד, 50 מיקרוליטר למיליליטר מערכת הבידוד של נויטרופילים לכל דגימת הדם.
מערבולת את חרוזים מגנטיים מתוך ערכת בידוד נויטרופילים במשך 30 שניות לפני השימוש על מנת resuspend חרוזים מגנטיים עדין מאוד. מוסיפים 500 מיקרוליטרים חרוזים מגנטיים לדגימה בדם ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
למעלה צינור עד 50 מיליליטר עם פתרון מלאי EDTA 2. זהו פתרון EDTA PBS מילימולארי אחד. מערבבים על ידי צינורות בעדינות רבה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים.
מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה, כדי למנוע תסיסה לאחר מכן של הצינור. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות פיפטה מועשרת השעיית תא המכיל נויטרופילים לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר.
אין לגעת בצד הצינור כי הוא במגע עם מגנט ולהימנע איסוף והתלהמות של תאי הדם האדומים בתחתית הצינור. השאירו בערך 10 מיליליטר של ההשעיה של תא הדם האדום מאחור בתחתית הצינור. מערבולת חרוזים מגנטיים במשך 30 שניות לפני השימוש ולהוסיף 0.5 מיליליטר חרוזים מגנטיים לצינור המכיל את נויטרופילים מועשרים.
מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה, כדי למנוע תסיסה הבאים.
דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות pipette ההשעיה תא מועשר המכיל נויטרופילים בצינור חרוט חדש 50 מיליליטר. אל תיגע בצד הצינור כי הוא במגע עם המגנט.
השאירו כחמישה מיליליטר של ההשעיה בתחתית הצינור. כדי להבטיח הסרה מלאה של חרוזים מגנטיים מתערובת התאים, מניחים צינור המכיל תאים מועשרים לתוך המגנט. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
בזהירות pipette ההשעיה תא מועשר כי עכשיו מכיל נויטרופילים טהורים לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר. אל תיגע בצד הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כחמישה מיליליטר של השעיה בתחתית הצינור.
למעלה תאים מבודדים עם פתרון מלאי EDTA מילימולרי אחד 2 לנפח סופי של כ 41 מיליליטר. פיפטה למעלה ולמטה לערבב. מחלקים את הפתרון באופן שווה לשני צינורות עם כ -20 מיליליטר בכל צינור.
צנטריפוגה שני הצינורות ב335G במשך חמש דקות. במהלך שלב הצנטריפוגה, קח את מלאי מעכבי MLi-2, 200 מיקרומולר קו נטוי 1000X ריכוז מתוך המקפיא מינוס 80 מעלות ולהשאיר בטמפרטורת החדר לשימוש הבא. מיד לאחר צעד הצנטריפוגה וללא תסיסה של הצינורות, לשפוך את supernatant מבלי להפריע כדורי נויטרופילים.
תן שימוש חוזר בכל גלולת תא ב-10 מיליליטר של תאים בינוניים בטמפרטורת החדר על-ידי צינורות עדינים של תאים למעלה ולמטה ארבע פעמים. תווית צינור אחד DMSO והשני צינור MLi-2. כדי DMSO שכותרתו צינור להוסיף 10 microliter של DMSO ולהוסיף 10 microliters של 200 פתרון מלאי MLi-2 micromolar על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה לערבב.
דגימות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך כל 10 דקות במהלך תקופת הדגירה. במהלך 30 דקות LRRK2 טיפול מעכבי קינאז להסיר 0.5 פתרון מלאי DIFP טוחן מן המקפיא מינוס 80 מעלות ומנחים ברדס אדים על קרח.
לאחר מכן, להעביר מיליגרם אחד לכל מיליליטר Microcystin-LR פתרון מלאי מן המקפיא מינוס 80 מעלות מקום בטמפרטורת החדר כדי להפשיר. להפשיר aliquot, 0.25 מיליליטר של חיץ תזה על ידי לקיחת אותו מהמקפיא, לאפשר להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם אותו על קרח לשימוש הבא. הכן מיליליטר אחד של מדיום RPMI המכיל מיקרוליטר אחד של DMSO קרא למאגר ההתכווצות מחדש DMSO זה.
הכן מיליליטר אחד של מדיום RPMI המכיל מיקרוליטר אחד של 200 מיקרומולאר MLi-2 או מעכב קינאז LRRK2 חלופי ולקרוא זה מאגר MLi-2 Resuspension. לאחר תקופת הדגירה של 30 דקות, צנטריפוגה שני הצינורות ב 335G במשך חמש דקות, כמו קודם. בזהירות להשליך את supernatant בכל צינור מבלי להפריע גלולת נויטרופילים.
עבור הצינור המסווים DMSO, התן בעדינות גלולה במיליליטר אחד של מאגר ההתכווצות של DMSO. ולצינור המסויר MLi-2, תן שימוש חוזר גלולה במיליליטר אחד של חיץ ההמשך MLi-2. העבר כדורי תאים מתווסתים לצינורות צנטריפוגה תואמים שכותרתו DMSO ו- MLi-2 וצנטריפוגה שני הצינורות ב 335G במשך שלוש דקות.
במהלך שלב הצנטריפוגה, הכן את מאגר התמוגה. במכסה המנוע של האדים, הוסיפו בזהירות 0.25 מיקרוליטרים של תוסף DIFP טוחן 0.5, כמו גם 0.25 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר מיקרוציסטין-LR למאגר תמוגה 0.25 מיליליטר. מערבבים ומשאירים על קרח עד לשימוש.
מיד לאחר הצנטריפוגה, בזהירות לחלוטין להסיר את כל supernatant עם פיפטה מבלי להפריע גלולה נויטרופילים מניחים צינורות על קרח. מיד להוסיף 100 microliters של מאגר תיזה המכיל DIFP ומיקרוציסטין-LR לכל צינור. באמצעות פיפטה של 100 עד 200 מיקרוליטר, השתמש מחדש כדורי התא על ידי צינור למעלה ולמטה על חמש עד 10 פעמים.
שכב תאים על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, צינורות צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. העבר DMSO ו MLi-2 על טבעי המכיל lysates נויטרופילים לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים.
השלך כדורי פסולת. ליזטים נויטרופילים מוכנים כעת לשימוש או ניתן לצלם קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן במינוס 80 מעלות לניתוח עתידי. באמצעות נתונים ממאגר היבוא הזמין לציבור, גרף זה מראה כי שפע של חלבוני LRRK2 ו- Rab10 גבוה במיוחד בנייטרופילים ומונוציטים של דם היקפי אנושי.
בידוד נויטרופילים בדם היקפי אנושי עם הליך זה גורם לתפוקה טמאה גבוהה של תאים. הטבלה בחלק העליון מראה את המספר הכולל של תאים מבודדים מ 10 מיליליטר של דם היקפי משלושה תורמים בריאים. כמו כן מוצגים טוהר וכדאיות של התאים המבודדים, כמו גם תפוקת ליזאט חלבון הכוללת.
לאחר טיפול עם וללא מעכב קינאז LRRK2, MLi-2, נויטרופילים הם lysed בנוכחות מעכב פרוטאז חזק, DIFP. עבור איור B בצד שמאל, 10 מיקרוגרם של תמציות תאים שלמים לכל נתיב היו נתונים לניתוח אימונובלו כמותי מולטיפלקס עם הנוגדנים שצוינו. הנתון מימין, C, מדגים את החשיבות של DIFP למניעת השפלה פרוטאוליטית, במיוחד של חלבון LRRK2 הגדול.
לשם השוואה, ריכוזים גבוהים של PMSF לבד הם פחות יעילים. הנה הראה כי זרחון Rab10 נשלט LRRK2 גדל באופן משמעותי על ידי כשלושה נויטרופילים בדם היקפי נגזר חולים עם מחלת פרקינסון תורשתית מחסה מוטציה VPS35 D620N הטרוזית בהשוואה לפקדים. הגרף העליון מציג את ניתוח האימונובלו מולטיפלקס ואת החלק התחתון, כימות שלו.
הדבר מצביע על כך שהמוטציה VPS35 D620N מפעילה את נתיב הפעילות של LRRK2 kinase על ידי מנגנון שעדיין לא ידוע. לסיכום, אנו מציגים הערכה קלילה וחזקה למדידת פעילות מסלול LRRK2 kinase על ידי ניטור זרחון חלבון ראב, כגון Rab10, בנויטרופילים המופקים על ידי היקפי אנושי, שיטה זו מאפשרת לנו להעריך את פעילות מסלול LRRK2 ולקבוע כיצד מוטציות, מצבי מחלה או מעכבים לווסת את פעילות מסלול LRRK2.
