Bu işlemin genel amacı insan periferik kan endojen LRRK2 kinaz aktivitesini değerlendirmek için bir yöntem sağlamaktır. Bu, Michael J.Fox Vakfı fosfospesifik Rab monoklonal antikorların kullanımı yla Rab proteinlerinin LRRK2 aracılı fosforilasyonunun izlenmesiyle elde edilir. Burada, hem Rab2 hem de Rab10 yüksek ekspresyon düzeyleri ile homojen site popülasyonunun bir parçası olarak insan periferik kan nötrofiller üzerinde duruluyor.
Nötrofil izolasyonu, bitmiş eylem 40 dakika içinde% 99 saf ve canlı nötrofillerizolasyon sağlar aynı zamanda protein düzeyleri yüksek miktarda verim negatif bir seçim dayanmaktadır. Bir kan toplama tüpü içine 10 mililitre kan toplamak. Tüpleri 7-8 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
50 mililitrelik konik bir tüpe 10 mililitre kan aktarın. Kana 100 mikrolitre EDTA stok çözeltisi 1, 0.1 molar EDTA PBS Çözeltisi ekleyin, hafifçe karıştırın. Nötrofil izolasyon kitinden tüm kan örneğine 500 mikrolitre izolasyon kokteyli, mililitre başına 50 mikrolitre ekleyin.
Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 saniye boyunca girdaplayın. Kan örneğine 500 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.
EDTA stok çözeltisi 2 ile 50 mililitreye kadar tüp toplayın. Bu bir milimolar EDTA PBS Çözümü. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetting tarafından karıştırın.
Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat. Dikkatle pipet yeni bir 50 mililitre konik tüp içine nötrofiller içeren hücre süspansiyon zenginleştirilmiş.
Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyon yaklaşık 10 mililitre bırakın. Kullanmadan önce 30 saniye boyunca vortex manyetik boncuklar ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp 0.5 mililitre manyetik boncuk ekleyin.
Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yat. Dikkatle pipet yeni bir nötrofil içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon 50 mililitrekonik tüp. Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın.
Tüpün altında süspansiyon yaklaşık beş mililitre bırakın. Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat.
Dikkatle pipet şimdi yeni bir 50 mililitre konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon. Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Tüpün altında yaklaşık beş mililitre süspansiyon bırakın.
Yaklaşık 41 mililitre lik son hacmine kadar bir milimolar EDTA stok çözeltisi 2 ile izole hücreleri toplayın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için. Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mililitre olan iki tüpe eşit olarak bölün.
335G'de her iki tüpü de beş dakika santrifüj edin. Santrifüj adımı sırasında, MLi-2 inhibitör stok, eksi 80 derece dondurucu dışında 200 mikromolar eğik 1000X konsantrasyonu almak ve sonraki kullanım için oda sıcaklığında bırakın. Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün.
hücre lerini dört kez hafifçe borulandırarak oda sıcaklığında 10 mililitre hücre kültürü ortamıiçinde her hücre peletini yeniden askıya alın. Etiket bir tüp DMSO ve diğer tüp MLi-2. DMSO etiketli tüp için 10 mikrolitre DMSO ekleyin ve karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından 200 mikromolar MLi-2 stok çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin.
Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka örnekleri. Kuluçka döneminde her 10 dakikada bir ters çevrilerek hafifçe karıştırın. 30 dakika LRRK2 kinaz inhibitörü tedavisi sırasında eksi 80 derece dondurucu dan 0,5 molar DIFP stok çözeltisi kaldırmak ve buz üzerinde duman kaputyerleştirin.
Daha sonra, eksi 80 derece dondurucu dan mililitre Microcystin-LR stok çözeltisi başına bir miligram hareket ve çözülmek için oda sıcaklığında yer. Bir aliquot, dondurucu dan çıkararak lysis tampon 0.25 mililitre defrost, oda sıcaklığında defrost izin ve daha sonra kullanmak için buz üzerine yerleştirin. DMSO bir mikrolitre içeren RPMI orta bir mililitre hazırlayın bu DMSO Resuspension Tampon diyoruz.
200 mikromolar MLi-2 veya alternatif LRRK2 kiyazı inhibitörü bir mikrolitre içeren RPMI orta bir mililitre hazırlayın ve bu MLi-2 Resuspension Tampon diyoruz. 30 dakikalık kuluçka döneminden sonra, her iki tüpü de 335G'de her iki tüpü de daha önce olduğu gibi beş dakika santrifüj edin. Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.
DMSO etiketli tüp için, bir mililitre DMSO Resuspension Tampon'da peleti hafifçe yeniden askıya alın. Ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 Resuspension Tampon bir mililitre pelet resuspend. Yeniden askıya alınan hücre peletlerini DMSO ve MLi-2 etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 335G'de üç dakika santrifüj edin.
Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputunda, 0,25 molar DIFP çözeltisinin 0,25 mikrolitreyanı nın yanı sıra 0,25 mililitrelik lisis tamponuna mililitre başına bir miligram mikrolitre mikrolitre ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.
Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin. Hemen her tüp için DIFP ve mikrosistin-LR içeren lysis tampon 100 mikrolitre ekleyin. 100 ila 200 mikrolitrelik pipet kullanarak, hücre peletlerini yaklaşık 5-10 kez yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.
Hücreleri 10 dakika boyunca buzun üzerinde yat. Sonra, 20,000 kez G'de santrifüj tüpleri hücre enkazLarını temizlemek için 15 dakika boyunca 4 derece santigrat derece. Transfer DMSO ve MLi-2 supernatant içeren nötrofil lysates yeni santrifüj tüpleri içine.
Enkaz peletlerini atın. Nötrofil lysates şimdi kullanıma hazır veya sıvı azot dondurulmuş ve gelecekteki analiz için eksi 80 derece saklanabilir. Kamuya açık ithalat veritabanından elde edilen verileri kullanarak, bu grafik LRRK2 ve Rab10 proteinlerinin bir bolluk insan periferik kan nötrofiller ve monositler özellikle yüksek olduğunu göstermektedir.
Bu işlem ile insan periferik kan nötrofilleri izole hücrelerin yüksek kirli verim sonuçları. Üstteki tablo, üç sağlıklı donörden 10 mililitre periferik kandan izole edilen toplam hücre sayısını gösteriyor. Ayrıca izole hücrelerin saflığı ve canlılığının yanı sıra toplam protein lisat verimi de gösterilmiştir.
LRRK2 kinaz inhibitörü, MLi-2 ile ve olmadan tedaviden sonra nötrofiller güçlü proteaz inhibitörü, DIFP varlığında lysed edilir. Sol taraftaki Şekil B için, şerit başına 10 mikrogram tüm hücre ekstresi belirtilen antikorlarla çokkatlı kantitatif immünoblot analizine tabi tutuldu. Sağdaki figür, C, büyük LRRK2 proteini başta olmak üzere, proteolitik bozulmanın önlenmesi için DIFP önemini göstermektedir.
Buna karşılık, pmsf yüksek konsantrasyonlarda tek başına daha az etkilidir. Burada lrrk2 kontrollü Rab10 fosforilasyon önemli ölçüde kontrollere göre heterozigot VPS35 D620N mutasyonu barındıran kalıtsal Parkinson hastalığı olan hastalardan elde edilen periferik kan nötrofillerinde yaklaşık üç kat arttığı gösterilmektedir. Üst grafik multipleks immünoblot analizini ve alt kısmını, bunların niceliğini gösterir.
Bu, VPS35 D620N mutasyonunun henüz bilinmeyen bir mekanizma ile LRRK2 kinazisi aktive ettiğini göstermektedir. Özetle, rab10 gibi Rab protein fosforilasyonlarını insan periferik türevi nötrofillerde izleyerek LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir analiz salıyoruz, bu yöntem LRRK2 yol aktivitesini değerlendirmemize ve mutasyonların, hastalık durumlarının veya inhibitörlerinin LRRK2 yol aktivitesini nasıl modüle ettiğini belirlememize olanak sağlar.
