El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método para evaluar la actividad endógena de LRRK2 quinasa en la sangre periférica humana. Esto se logra mediante el monitoreo de la fosforilación mediada por LRRK2 de las proteínas Rab, empleando anticuerpos monoclonales Rab específicos de Fosfo de la Fundación Michael J.Fox. Aquí, nos centramos en los neutrófilos de sangre periférica humana como una consensuada de población de sitios homogéneos con altos niveles de expresión de Rab2 y Rab10.
El aislamiento de neutrófilos se basa en una selección negativa que dentro de los 40 minutos de la acción terminada permite el aislamiento de 99%neutrófilos puros y viables, al mismo tiempo que produce una alta cantidad de niveles de proteínas. Recoger 10 mililitros de sangre en un tubo de recolección de sangre. Mezclar suavemente invirtiendo los tubos de siete a ocho veces.
Transfiera 10 mililitros de sangre a un tubo cónico de 50 mililitros. Añadir a la sangre 100 microlitros de la solución de material EDTA 1, 0.1 molar EDTA PBS Solución, mezclar suavemente. Añadir 500 microlitros cóctel de aislamiento, 50 microlitros por mililitro del kit de aislamiento de neutrófilos a toda la muestra de sangre.
Vórtice las perlas magnéticas del kit de aislamiento de neutrófilos durante 30 segundos antes de su uso con el fin de resuspender cuentas magnéticas muy finas. Agregue 500 microlitros de perlas magnéticas a la muestra de sangre y mezcle suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Rebaste el tubo a 50 mililitros con la solución de stock EDTA 2. Esta es una solución EDTA PBS milimétrica. Mezclar muy suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces.
Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar la agitación posterior del tubo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Suspensión celular cuidadosamente enriquecida con pipeta que contiene neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.
No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán y evite la recolección y perturbación de los glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Deje aproximadamente 10 mililitros de la suspensión de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Cuentas magnéticas de vórtice durante 30 segundos antes de su uso y añadir perlas magnéticas de 0,5 mililitros al tubo que contiene los neutrófilos enriquecidos.
Mezclar suavemente invirtiendo el tubo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar la agitación posterior.
Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que contiene neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán.
Deje aproximadamente cinco mililitros de la suspensión en la parte inferior del tubo. Para asegurar la eliminación completa de las perlas magnéticas de la mezcla celular, coloque el tubo que contiene las células enriquecidas en el imán. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que ahora contiene neutrófilos puros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán. Deje aproximadamente cinco mililitros de suspensión en la parte inferior del tubo.
Rebaja las células aisladas con una solución de stock de EDTA milimolar 2 a un volumen final de aproximadamente 41 mililitros. Pipetear arriba y abajo para mezclar. Divida la solución por igual en dos tubos con aproximadamente 20 mililitros en cada tubo.
Centrifugar ambos tubos a 335G durante cinco minutos. Durante el paso de centrifugación, tome el caldo de inhibidores MLi-2, 200 micromolares de la concentración 1000X del congelador de menos 80 grados y déjelo a temperatura ambiente para su uso posterior. Inmediatamente después del paso de centrifugación y sin agitación de los tubos, verter el sobrenadante sin perturbar los pellets de neutrófilos.
resuspender cada pellet celular en 10 mililitros de medio de cultivo celular a temperatura ambiente pipeteando suavemente las células hacia arriba y hacia abajo cuatro veces. Etiquetar un tubo DMSO y el otro tubo MLi-2. Para el tubo etiquetado DMSO añadir 10 microlitro de DMSO y añadir 10 microlitros de 200 micromolar MLi-2 solución de stock por pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Incubar muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mezclar suavemente por inversión cada 10 minutos durante el período de incubación. Durante el tratamiento con inhibidores de la quinasa LRRK2 de 30 minutos, retire la solución de 0,5 molares DIFP del congelador de menos 80 grados y colóquela en una campana de humo sobre hielo.
A continuación, mueva un miligramo por mililitro De la solución de stock microcystin-LR desde el congelador de menos 80 grados y colóquelo a temperatura ambiente para descongelar. Descongelar una alícuota, 0,25 mililitros del tampón de la lesis sacándolo del congelador, permitir descongelar a temperatura ambiente y luego colocarlo en hielo para su uso posterior. Prepare un mililitro de medio RPMI que contenga un microlitro de DMSO llame a este búfer de resuspensión DMSO.
Preparar un mililitro de medio RPMI que contenga un microlitro de 200 micromolares MLi-2 o un inhibidor alternativo de la quinasa LRRK2 y llamar a este búfer de resuspensión MLi-2. Después del período de incubación de 30 minutos, centrifugar ambos tubos a 335G durante cinco minutos, como antes. Deseche cuidadosamente el sobrenadante en cada tubo sin alterar el pellet de neutrófilos.
Para el tubo etiquetado DMSO, resuspend suavemente pellet en un mililitro de DMSO Resuspension Buffer. Y para el tubo etiquetado MLi-2, pellet resuspend en un mililitro de MLi-2 Resuspension Buffer. Transfiera los gránulos de células resuspendidas a los tubos de centrifugación correspondientes etiquetados con DMSO y MLi-2 y centrifugar ambos tubos a 335G durante tres minutos.
Durante el paso de centrifugación, prepare el tampón de lelisis. En la campana de humo, agregue cuidadosamente 0,25 microlitros de solución DIFP 0,5 molares, así como 0,25 microlitros de un miligramo por mililitro de microcistina-LR al tampón de 0,25 mililitros de lílisquel. Mezclar y dejar sobre hielo hasta que lo use.
Inmediatamente después de la centrifugación, retire cuidadosamente y completamente todo el sobrenadante con una pipeta sin molestar el pellet de neutrófilos y coloque los tubos sobre hielo. Añadir inmediatamente 100 microlitros de tampón de lelisis que contengan DIFP y microcystin-LR a cada tubo. Usando una pipeta de 100 a 200 microlitro, resuspender los pellets celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cinco a 10 veces.
Acostar las células sobre hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugar tubos a 20.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los desechos celulares. Transfiera DMSO y MLi-2 sobrenadantes que contienen licatos de neutrófilos en nuevos tubos de centrifugación.
Deseche los pellets de escombros. Los analitos de neutrófilos ya están listos para su uso o pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a menos 80 grados para su análisis futuro. Utilizando datos de la base de datos de importación disponible públicamente, este gráfico muestra que la abundancia de las proteínas LRRK2 y Rab10 es particularmente alta en neutrófilos y monocitos de sangre periférica humana.
Aislar a los neutrófilos de sangre periférica humana con este procedimiento da como resultado un alto rendimiento impuro de las células. La tabla en la parte superior muestra el número total de células aisladas de 10 mililitros de sangre periférica de tres donantes sanos. También se muestran la pureza y viabilidad de las células aisladas, así como el rendimiento total del lisado proteico.
Después del tratamiento con y sin el inhibidor de la quinasa LRRK2, MLi-2, los neutrófilos se lecien en presencia del potente inhibidor de la proteasa, DIFP. Para la figura B en el lado izquierdo, 10 microgramos de extractos de células enteras por carril fueron sometidos a análisis de inmunoblot cuantitativo multiplex con los anticuerpos indicados. La figura de la derecha, C, demuestra la importancia de DIFP para la prevención de la degradación proteolítica, en particular de la gran proteína LRRK2.
En comparación, las altas concentraciones de PMSF por sí solas son menos eficaces. Aquí se muestra que la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 se incrementa significativamente en aproximadamente tres veces en los neutrófilos de sangre periférica derivados de pacientes con enfermedad de Parkinson hereditaria que alberga una mutación heterocigota VPS35 D620N en comparación con los controles. El gráfico superior muestra el análisis de inmunoblot multiplex y la parte inferior, la cuantificación de los mismos.
Esto sugiere que la mutación VPS35 D620N activa la ruta de actividad de la quinasa LRRK2 por un mecanismo aún desconocido. En resumen, presentamos un ensayo fácil y robusto para medir la actividad de la vía quinasa LRRK2 mediante el seguimiento de la fosforilación de la proteína Rab, como Rab10, en neutrófilos humanos de origen periférico, este método nos permite evaluar la actividad de la vía LRRK2 y determinar cómo las mutaciones, los estados de la enfermedad o los inhibidores modulan la actividad de la vía LRRK2.
