从钙成像实验中获取大量数据的能力已大大提高，尤其是组织成像实验。我们的协议描述了用于量化和描述这些数据集的适当分析技术。我们的协议生成一系列空间、时间和强度值，这些值是整个组织中钙信号所固有的，在更基本的分析中可能会丢失这些值。
在成像前一小时，从具有Cajal或ICC间细胞的小鼠中采集的小肠，这些小肠专门将基因编码的钙指示器表达到旋转盘共合显微镜的阶段。并持续用37摄氏度的克雷布斯-林格碳酸氢盐或KRB溶液对组织进行持续吸附。使用 60 到 100 X 放大镜定位小肠的圆形和纵向平滑肌肉层之间的硬质状肠状肠状丛ICC或ICC-MY。
然后将主轴形状的深肌肉丛ICC或ICC-DMP定位在圆形平滑肌肉层和亚木科形丛之间的单平面上，将影片保存为一叠TIFF图像。要创建 ICC-DMP 钙活性的时空贴图或 SM，请打开 ImageJ 中的图像堆栈，然后单击"图像、类型"和"32 位"以修改图像质量。要创建线扫描，请右键单击线选择工具并选择分段线。
使用单个左键单击沿单个 ICC-DMP 的中游绘制一条线，当整个单元格被勾勒出后，双击。选择图像、堆栈和重新滑梯。将显示一个弹出窗口。
选择"旋转 90 度"可从左向右定位线扫描，以便可以校准线扫描，并针对 x 轴上的时间读取，并在 y 轴上显示空间，然后单击"确定"。将出现时空地图。要准确测量地图中钙信号的振幅，请选择矩形选择，并在 STM 内显示最均匀、最不强烈的荧光区域的区域周围绘制一个感兴趣区域。单击"分析"和"直方图"以获取所选感兴趣区域内强度的均值，然后单击"编辑、选择、选择全部"以选择整个 STM。
接下来，单击"过程"、"数学"和"分割"，并在弹出框中使用所选的 STM 区域输入强度的均值。STM 将变黑。通过单击弹出窗口中的"图像、调整、亮度/对比度"和"自动"来更正这一点。
线扫描现在将校准振幅，荧光的强度表示为荧光除以零荧光。STM 将显示 x 轴上的 TIFF 堆栈中的帧数以及表示 y 轴上单元格长度的像素数。要量化钙信号的时空数据，请单击"图像和属性"并输入相应的值，以在弹出窗口中完全校准 STM 的空间和时间。
要分析单个钙事件，请单击"直线"并单击并拖动 STM 以通过与 x 轴平行的钙事件中心绘制一条直线水平线。然后单击"分析和绘制配置文件"。将显示一个框，显示钙事件的情节配置文件。
要对 ICC-MY 钙信号数据进行基于粒子的分析，请在音量中打开影片文件，右键单击以选择 STK 过滤器，进行区分。再次右键单击以输入要区分的值。按 Enter 和左键单击以启动差异化。
要创建粒子，请使用鼠标中间按钮滚动影片，选择包含静止周期的 20 到 40 帧部分，然后是钙瞬态聚类和群集后 20 到 40 帧的间隔。当在影片窗口中选择所有帧时，右键单击以访问 STK OPS Ramp DS 粒子信息，然后单击以运行粒子分析例程，该例程将逐步将阈值从最大值提升至最小强度。为确保成功的粒子分析，请确保尽可能多地包含钙前瞬态聚类非活性，以及尽可能多的钙后瞬态聚类非活性。
这将有助于提高信噪比。分析将在绘图窗口中以图形方式显示为噪声图，在跟踪窗口中显示为三种颜色轨迹，绿色轨迹表示粒子数，红色轨迹表示平均颗粒大小，蓝色轨迹表示绝对强度阈值。要平衡直方图，粒子噪声图按键盘上的 H。
然后按右括号键循环通过配色方案，直到背景为白色，顶部有颜色痕迹。一次按键盘上的 F 可启动测量工具。然后按 F 第二次，在有色图开始向右侧移动的交叉点处的绘图上的轨迹窗口的滚动条中标记一条垂直线。
在跟踪窗口中，使用鼠标中间按钮从红色轨迹的拐点滚动到标记的白色垂直线。注意到显示的 Y 平均值后，再次单击跟踪窗口中的中间鼠标按钮以取消选择蓝色跟踪。在影片窗口中单击 C 以启动色轮，单击 D 以调整阈值。
有效粒子现在显示为红色，饱和的粒子将为白色。使用鼠标左键滚动，直到删除白色区域，并使用鼠标中间按钮将色轮中的黄色数值调整为 Y 平均值，以在确定阈值点将红色所有内容作为活性钙瞬态颗粒分配。要将数据另存为基于坐标的粒子文件，右键单击以访问 STK 3D，请保存粒子零，左键单击以保存文件。
要创建粒子活动热图，请打开保存的粒子文件，并在影片窗口中右键单击以访问粒子 STKops、StatMap 标志并输入要分析的标记分配。单击以应用分析和热图，显示整个记录长度的总粒子，具有不同的颜色，表示整个录制过程中发生的百分比。右键单击以将热图保存为 TIFF 文件。
然后在影片窗口中右键单击以访问粒子度量、粒子统计 STK 等于，并输入用于分析的标记分配。将在跟踪窗口中生成一系列跟踪。STM 分析提供监控和记录钙信号的空间特征的能力，例如空间传播和传播速度。
这些信息可以积累起来，以提供一个相当完整的钙信号行为在其原生环境中的细胞。利用粒子分析，可以通过测量粒子面积和粒子计数来计算钙信号的定量信息，这些量值一起可用于确定指定视野内钙信号激活的空间范围。粒子分析还允许通过检查钙燃烧点的位置和发射概率，对亚细胞钙信号进行深度定量。
通过将粒子根据时间特征分配给不同的标志，可以精确映射启动粒子。在启动站点数量、站点大小（以像素和千分）为单位、每个启动站点在每个钙瞬态聚类中发射一次或多次的概率以及每个钙瞬态聚类周期中发射位置的百分比等获取大量硬数据。一致性是此协议成功的关键。
所有数据集和所有影片必须完全相同，以确保可靠、可重复的结果。在处理粒子文件时尤其如此。我们的协议允许对钙信号进行深层原位表征，一系列统计方法在适当使用时可以评估一系列空间和时间参数之间的差异。
我们的协议中的这些分析技术使研究人员能够提出和回答以前无法解决的问题，这些问题与肠道起搏、肠道内膜以及下尿道的神经元控制有关。
