This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

我们提出了详细的程序，成像在人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞局部钙事件。这些程序可适应图像内Ca 2+信号在许多细胞类型8-10。 1.准备细胞<ol><li>培养细胞根据他们的供应商的网站上列出的指令进行成像。 </li><li>在成像之前的几天，收获细胞生长在用1ml的0.25％胰蛋白酶/ EDTA（2-3分钟）的组织培养瓶。下面脱离，加培养基等体积以灭活胰蛋白酶。 </li><li>以每培养皿3-7×10 4个细胞的密度进行使用血球和种子细胞进入玻璃底成像菜细胞计数。选择细胞成像实验，当他们达到60％汇合（2-3天）。 </li></ol> 2.准备解决方案和试剂<ol><li>准备一个缓冲的钙含HEPES盐溶液（ 钙 -HBSS）（MM）组成：135氯化钠，氯化钾5.4，2 氯化钙 ，氯化镁1 2，10 HEPES和10葡萄糖; pH值= 7.4，在室温（RT）下用NaOH。制备的Ca 2+ -HBSS而不在4℃下加入葡萄糖和存储的;添加葡萄糖的溶液在使用前立即。 </li><li>溶解荧光钙离子指 ​​示剂校准- 520（1毫米）的膜透膜物的形式，CI-IP 3（200μM），和EGTA（100毫摩尔）在二甲基亚砜（DMSO）含有20％普流尼克F-127。分装这些试剂进Eppendorf管中并储存，防潮和避光，于-20℃下。 </li></ol> 3.细胞装载膜穿透物加州-520，CI-IP 3和EGTA <ol><li>分别稀释储备溶液膜穿透物校准-520和C的IP 3至5微米和1微米，使最终浓度，对Ca 2+ -HBSS制备“装载缓冲器”。 </li><li>吸立方米lture媒体与钙 -HBSS三次更换介质漂洗细胞。 </li><li>删除钙 -HBSS，并培育细胞样缓冲液在室温下在黑暗中60分钟。 </li><li>卸下装 ​​载的缓冲区，并通过与钙离子-HBSS三次更换介质漂洗细胞。 <ol><li>如果需要的话，在该步骤中，测力传感器用EGTA / AM通过稀释原液至5微米的Ca 2+ -HBSS终浓度，然后孵育细胞在室温在黑暗中30-60分钟。按照此孵育后，进到步骤3.5之前冲洗细胞三次， 钙 -HBSS。 </li></ol></li><li>孵育细胞中的Ca 2+ -HBSS 30分钟，以允许用于脱酯化装载试剂。 </li><li>紧接在成像之前，取代的Ca 2+ -HBSS与“新鲜”的Ca 2+ -HBSS为了除去最后的孵化过程中可能已流入浴任何染料。 </li></ol> 4. 钙 </sup&gt;图像采集<ol><li>将一小滴浸油到100X APO TIRF目标（NA 1.49）。 </li><li>安装在倒置显微镜的阶段成像盘，并使用透射光使细胞进入焦点。它以固定的成像盘，以防止在记录过程中的运动是很重要的。 </li><li>照亮以激发校准-520，并收集用高速EMCCD相机发射的荧光（λ&gt; 510纳米）的细胞用488nm的激光。 注：操作该显微镜软件包允许用户平移一聚焦透镜使激光束被引入或者在目标背孔（用于激发TIRF）以上集中（对于“WF”激发）的末端边缘。 </li><li>使用EMCCD软件，从完整的512×512象素减少，以便收集数据，在必要的时间分辨率来捕捉本地的Ca 2+事件的摄像视场。 注：例如，中心四收购的256×256像素加快并购速度，以66 fps的。另外，也可以使用一个分离的作物模式功能，以进一步增加EMCCD摄像机的帧频为500帧。 </li><li>配置软件自动记录基线活性的几秒钟，递送的UV闪光对细胞和继续录制另一10-30秒。 注：紫外线闪光灯使用通过紫外线反射在显微镜的后部端口分色镜引入氙弧光源递送。紫外线闪光的持续时间和强度被调整凭经验唤起的本地的Ca 2+事件的期望的频率。 </li><li>将文件保存为图像叠加的离线分析。 </li></ol> 5.自动钙图像分析注：可以查看，处理和利用许多商业软件包，分析捕获的数据。但是，我们已经开发了一种算法，以迅速确定自动化的当地的钙信号D分析。该算法中所使用的空间和时间的过滤器的详细说明，生成的ΔF/ f 0的鉴定和/分析例程可以在11找到。该算法已经发展到在开源软件平台的Python运行，并且能够获得，连同样品的实验数据和详细的用户指令，通过电子邮件发送相应的作者（ismith@uci.edu）。 <ol><li>转换文件被导入到自定义编写算法的多平面.tiff格式的文件格式。 </li><li>找到包含分析算法的文件夹，然后双击run.exe。 </li><li>选择.TIFF文件进行分析。 </li><li>选择在打开的对话​​框中分析参数。参见图2A为默认参数的样本数据。 </li><li>确定的黑色电平被从图像堆栈通过移动光标到的视场的，做为n的部分偏移OT包含电池（参见图2B），或通过手动输入黑电平使用“设置黑电平”的提示。 </li><li>观察四个窗口在屏幕上继软件（ 图2C-F）分析。 C是静止从细胞中荧光的单色图像被分析。叠加在该图像的白色方块是事件的地点，判断为装配到事件的二维高斯函数的质心位置。 </li><li>点击每个事件的位置，或者按光标键事件之间循环。在这样的背景中减去，高斯在这些网站更新窗口D的平滑荧光强度的变化（ΔF/女0） 注：红色突出显示的事件，决心从特定网站发起，而不是从&#39;流血通“从活动定位于相邻的站点。较低的蓝色线指示了在所选网站上的荧光信号超过检测的阈值，而黑线识别的事件，从该特定网站的始发（对应于红色突出显示事件）。 </li><li>点击一个红色高亮显示事件更新窗口Ë显示事件的时空演化和窗口F，可以显示该事件的空间分布平均的时间过程，与拟合高斯函数的空间分布在一起。 </li><li>手动检查已确定，这样的文物可以从分析被拒绝的事件。右键单击红色删除这些事件突出事件。 注：在我们的手中， 钙离子通量通过单一IP 3 R声道唤起信号与ΔF/ f 0的约0.11，所以任何检测“事件”明显比这更小的很可能是误报。 </li><li>通过选择“保存到Excel”或导出数据在每个小区所感兴趣的细胞周围绘制，然后选择“保存CellR导出数据17 ;. 注：数据被保存到同一文件夹与原始图像堆栈。 </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

在这里，我们描述了协议成像培养的哺乳动物细胞局部钙事件使用荧光钙指标。此外，我们描述了一种算法可以自动识别和获取的数据进行分析的直观的用户界面。这里所描述的方法利用荧光钙指标加州-520，但其他许多钙敏感染料如荧光- 3，荧光4，荧光- 8和俄勒冈州绿BAPTA-1进行足够好图像的Ca 2+微区。护理确实需要采取以确保这些指标的高亲和性的版本?...

钙离子（ 钙 ）遍在调节生物学过程，包括基因表达，分泌和在突触可塑性1持久的变化的一个不同的范围。通过这些钙离子可以在这样一个多元化的方式行事的一种方法是通过钙离子的不同的时空格局预示着细胞可以生成。对于胞浆例如全球海拔在平滑肌组织2而较小的[Ca 2+]触发收缩，局部的暂时升高（局部钙微区）刺激基因表达的学习和记忆至关重要的3。 游离胞质内[Ca 2+]被维持在约100纳米处，休息，但能迅速通过钙上升到几个微摩尔以下的Ca 2+的流入到胞质溶胶定位于质膜和由2+ -permeable离子通道钙离子从细胞内的S中解放tores。我们实验室的重点是肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP 3 R），其形成位于内质网（ER）膜中的钙释放通道。一旦这两个IP 3和Ca 2+胞浆激活受体位点结合，将IP 3 R通道打开，释放钙离子的ER管腔内隔离。的Ca 2+的释放可保持空间限制到一小簇的IP 3卢比生成的Ca的本地胞质微区2+（钙离子粉扑4），或者，依赖于邻近簇的IP 3 Rs的接近度，可通过钙离子诱导的Ca 2+ -释放（CICR）5,6的过程中多个招聘网站噗传播在整个细胞。 荧光小分子的Ca 2+指示剂染料引入由Roger开发钱学森7，再加上先进的显微镜意马纳克技术，极大地方便了我们的Ca 2+信号的认识。在用于显微镜相机最近的进展，现在允许成像瞬态本地的Ca 2+的事件，如喷以前所未有的空间和时间分辨率。目前可用的EMCCD相机使成像128×128象素，在&gt; 500帧秒-1（fps）的和新一代互补金属氧化物半导体的（CMOS）摄像机提供更高的像素分辨率，并且在稍高的费用，甚至更快的速度噪音水平。在与全内反射（TIRF）显微镜结合使用，现在可以像单钙通道事件8,9。这种方法允许数百同时频道/事件的成像，同时产生大的数据集（每分钟大约 1Gb的），该渲染人工处理，视觉识别和分析不可行和放置一个责任上的自动算法的发展。 钙指标成像在完整的哺乳动物细胞局部钙信号的程序和协议。我们进一步证明了开源环境的Python可以自动识别本地钙事件双方TIRF和传统的宽视场落射荧光（WF）显微成像和分析开发了一种算法。尽管我们描述了这些方法中的IP 3 -生成的Ca 2+信号的情况下，它们是很容易适合于研究在胞浆内[Ca 2+]从各种钙发出位于任一表面2+ -permeable离子通道的局部变化细胞膜或细胞内的细胞器8-10。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

胞质的Ca 2+离子的调节在几乎所有类型的细胞的细胞活性的许多方面，控制流程作为广泛作为基因转录，电兴奋性和细胞增殖。 钙离子信号的多样性和特异性的发生在几分钟到局部瞬时钙微区的时间用来生成钙信号采取行动在不同的时间和空间尺度的机制，从细胞级振荡和电磁波派生（ 钙离子喷）持久毫秒。在电子的最新进展乘以CCD（EMCCD）相机，现在允许本地钙信号与128×128像素的空间分辨率成像为&gt; 500帧秒-1（fps）的速率。这种方法是高度并行的，并能够在一个单一实验中同时监测数百个频道或粉扑站点的。然而，所产生的大量数据（ 约 1千兆PER最小值）渲染视觉识别本地钙和分析2+事件不可行。在这里，我们将介绍和演示程序的采集，检测，以及本地IP 3介导的钙信号加载同时使用宽视场落射荧光（WF）和全内反射钙指标完整的哺乳动物细胞分析荧光（TIRF）显微镜。此外，我们描述了开放源码的软件环境的Python，自动化这些地方的钙离子信号的识别和分析中开发了一种算法。该算法本地化的钙释放与子像素分辨率的场所;允许数据的用户查看;输出的荧光信号比时间序列与幅度和动力学数据在Excel兼容的表格。

图1A示出了静息校准-520荧光在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞还装载了CI-IP 3的WF图像。曝光这些细胞到一个100毫秒的UV闪光灯光释放的i-IP 3引起短暂的Ca 2+喷在离散的位点（由白圈在图1A中说明）。在这些位点测得的荧光的痕迹显示由于知识产权3卢比短暂的开口，随后是慢得多的下降沿相位（ 图1B和1C），为的Ca一个快?...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

成像本地CA<sup&gt; 2+</sup&gt;在培养的哺乳动物细胞信号

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K 次观看.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.