前体小鼠膈肌三方突触细胞特异性钙信号的影像学研究

这种方法可以帮助回答神经肌肉领域的关键问题，如钙信号在肌肉或Schwann细胞中对神经刺激的反应的作用。这种技术的主要优点是，可以形象地激活特定的细胞类型，以回应神经刺激。首先，获得转基因小鼠，并基因型它们，如文本协议中详细说明。

安乐死后，用虹细胞切除术剪刀横切整个动物，在肝脏下方和心脏和肺部上方。解剖肝脏、心脏和肺部。小心保持一个足够长的咽神经长度，以被吸引到吸力电极中。

进一步去除肋骨笼和椎柱，隔膜周围的薄脊除外。将隔膜和肾神经样本放在微模糊管中，用 Krebs-Ringer 溶液，每毫升含有一微克的荧光标记的α邦加罗毒素。让试样在黑暗中在溶液中孵育10分钟。

使用小针固定隔膜，将其固定在涂有硅胶的六厘米盘上，并填充约八毫升氧氧克雷布斯-林格溶液。将盘子放在显微镜的舞台上。然后，以每分钟 8 毫升的速度将隔膜与更多 Krebs-Ringer 溶液相近，使用 30 分钟。

在四倍放大时，使用微操纵器将吸力电极移动到左神经上。通过拉出连接到吸管的五毫升注射器筒，施加吸力。通过使用 Brightfield 照明目视检查隔膜，确保隔膜收缩以响应一赫兹刺激。

如果没有，通过增量转动电压旋钮来调节电压，从而达到一个超能量脉冲，可以通过肌肉收缩的目视检查来验证。如果仍然不可见，用注射器吹出神经，并尝试通过吸力再次吸入。现在，关闭灌注添加肌肉特异性肌素抑制剂BHC或电压门控钠通道拮抗性木康多毒素。

在一毫升的克雷布斯-林格溶液中，将四根200毫摩尔库存BHC的微升移液，准备BHC预稀释。从盘子中取出一毫升的克雷布斯-林格溶液。然后将预稀释的BHC加入到菜中。

30 分钟后，再打开新鲜 Krebs-Ringer 溶液的灌注 20 到 30 分钟。戴上手套，将外径为一毫米、内径为 0.4 毫米的硅丝玻璃放入微移子拉拔器中，准备记录电极。拧紧表盘以将其夹紧到位并关闭拉拔门。

然后对拉拔器进行编程，如文本协议中所述。对于胚胎隔膜，使用放大器的软件控制测量电阻。确保电阻接近 60 兆欧姆，对于较旧的隔膜，10 到 20 兆欧姆。

现在，用三个摩尔氯化钾加载记录电极。在放大倍数 10 倍时，使用舞台对面的第二个微操纵器将电极降为肌肉，作为刺激电极。使用电生理数据采集软件等待，直到静膜电位从零到零 65 毫伏以下变化。

刺激在一赫兹，并验证肌肉动作潜力的存在，通过检查一个大的潜力，表现出一个适度的过冲。不要将刺激工件与动作电位混淆。在20倍的放大率下，通过寻找在绿色黄光激发下荧光标记的α bungarotoxin神经肌肉结，定位肌肉中心的端板带。

切换到蓝光激发，以在肌肉、运动神经元或施万细胞中成像钙反应。在此示例中，GCAMP 3 以肌肉细胞表示。如果需要，使用带通滤波器和双波长成像的双色单刃滤波器设置图像分割器。

使用查找表栏上的亮度条进行实验，将亮度条设置为表示组织的遗传编码钙指示器在 20 倍放大时表现出饱和度，而不会对氯化钾进行装箱。以每秒 20 帧的速度录制，因此不会错过任何快速事件。使用吸电极提供一系列脉冲，并收集一个细胞子类型的动态荧光钙反应以及静态荧光标记的α bungarotoxin神经肌肉结信号，以 1 至 45 秒的 20 至 40 赫兹刺激神经刺激。

药理激动剂也可以通过沐浴应用或灌注添加，动态荧光钙反应可以收集相同的方式。当成像或电生理实验完成，因为已经取得了预期的结果，通过灌注线吸水，并通过吸水电极吸水两到三次，以确保盐不积聚。Schwann 细胞钙对 Wnt 一个 GCaMP 三小鼠隔膜在产后第 7 天的肾神经刺激的空间图显示了对神经肌肉结端寄生 Schwann 细胞的限制。

同样的隔膜在贴有荧光标记的α双糖毒素后被成像，该标记键连接，使神经肌肉结的乙酰胆碱受体。同样的隔膜也在光明场照明下被成像，以引导记录电极到神经肌肉结的肌肉突触后区域。此处显示的是颜色编码细胞的空间划分或用于分析单个钙瞬变的感兴趣区域。

在肌素抑制剂BHC存在的情况下，第5个月第5个GCaMP三只小鼠膜片的肌肉细胞钙反应的空间图显示了整个区域的所有膜片肌肉细胞的反应。相比之下，在粘膜毒素存在的情况下刺激同一膜片会导致所有与乙酰胆碱受体聚类富集端板带对应的膜片肌肉细胞的中区空间受限钙反应。按照这个程序，其他方法，如免疫组织化学或免疫印迹可以执行，以回答其他问题，如，什么是细胞的分子配置文件由电生理学或钙成像？

这种方法可以深入了解Schwann细胞和肌肉细胞对正常新生儿小鼠神经刺激的种群反应。它也可以应用于研究老年小鼠或研究小鼠表达神经肌肉疾病相关蛋白质。