칼슘 이미징 실험에서 대량의 데이터를 수집할 수 있는 능력은 특히 조직 이미징 실험으로 크게 개선되었습니다. 당사의 프로토콜은 이러한 데이터 집합을 정량화하고 설명하는 적절한 분석 기술을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 전체 조직에서 칼슘 신호에 내재된 공간, 시간적 및 강도 값의 범위를 생성하며 이는 보다 기본적인 기반 분석에서 손실될 수 있습니다.
이미징 전송 1 시간 전에 Cajal 또는 ICC의 간질 세포가있는 마우스에서 수확 한 소장은 특히 회전 디스크 공초점 현미경의 단계로 유전적으로 인코딩 된 칼슘 지표를 표현합니다. 그리고 지속적으로 37섭씨 크렙스 링거 중탄산염 또는 KRB 용액으로 조직을 침투한다. 60 받는 사람은 X 배율로 작은 장의 원형과 세로의 매끄러운 근육 층 사이에 스텔레이트 모양의 myenteric 신경총 ICC 또는 ICC-MY를 찾습니다.
그런 다음 원형 부드러운 근육 층과 부점진 신경총 사이의 단일 평면에서 스핀들 모양의 깊은 근육 신경총 ICC 또는 ICC-DMP를 찾아 TIFF 이미지의 스택으로 영화를 저장합니다. ICC-DMP 칼슘 활동의 현면 맵 또는 STM을 생성하려면 ImageJ에서 이미지 스택을 열고 이미지, 유형 및 32비트를 클릭하여 이미지 품질을 수정합니다. 라인 스캔을 만들려면 선 선택 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 분할된 선을 선택합니다.
왼쪽 단일 클릭을 사용하여 개별 ICC-DMP의 중간 액세스를 따라 선을 그리며 전체 셀이 윤곽을 그리면 두 번 클릭합니다. 이미지, 스택 및 다시 슬라이스를 선택합니다. 팝업 창이 나타납니다.
90도 회전을 선택하여 라인 스캔을 왼쪽에서 오른쪽으로 방향을 지정하여 y축의 공간이 있는 x축에서 시간에 대해 보정하고 읽을 수 있도록 확인을 클릭합니다. 현면지도가 나타납니다. 지도에서 칼슘 신호의 진폭을 정확하게 측정하려면 직사각형 선택을 선택하고 가장 균일하고 가장 강렬한 형광 영역을 표시하는 STM 내 영역 주변의 관심 영역을 그립니다. 분석 및 히스토그램을 클릭하여 선택한 관심 지역 내강도의 평균 값을 얻고 편집, 선택, 전체 STM을 선택하려면 모두 를 클릭합니다.
다음으로, 프로세스, 수학 및 분할을 클릭하고 팝업 상자에 관심있는 선택한 STM 영역과 강도의 평균 값을 입력합니다. STM은 검은색으로 바뀝니다. 팝업 창에서 이미지, 조정, 밝기/대비 및 자동을 클릭하여 이 수정합니다.
선 스캔은 이제 형광의 강도가 제로 형광으로 나누어진 형광의 강도로 진폭을 보정한다. STM은 x축의 TIFF 스택의 프레임 수와 y축의 셀 길이를 나타내는 픽셀 수를 표시합니다. 칼슘 신호로부터 시간적 및 공간 데이터를 정량화하려면 이미지 및 속성을 클릭하고 적절한 값을 입력하여 팝업 창에서 의 공간과 시간에 대해 STM을 완전히 보정합니다.
개별 칼슘 이벤트를 분석하려면 직선을 클릭하고 STM을 클릭하고 드래그하여 x축과 평행한 칼슘 이벤트의 중심을 통해 직선 수평 선을 그립니다. 그런 다음 프로파일 분석 및 플롯을 클릭합니다. 칼슘 이벤트의 플롯 프로파일을 보여주는 상자가 나타납니다.
ICC-MY 칼슘 신호 데이터의 입자 기반 분석을 위해 볼륨트리에서 영화 파일을 열고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 STK 필터를 선택합니다. 다시 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 차별화할 값을 입력합니다. Enter를 누르고 왼쪽 단추를 클릭하여 차별화를 시작합니다.
입자를 만들려면 중간 마우스 버튼을 사용하여 영화를 스크롤하여 정지 기간을 포함하는 20~ 40프레임 섹션을 선택하고, 그 다음에는 칼슘 과도 클러스터와 클러스터 바로 뒤에 따라 20~40프레임이 발생합니다. 모든 프레임이 동영상 창에서 마우스 오른쪽 단추로 선택되면 STK OPS 램프 DS 파티클 정보에 액세스하고 클릭하여 임계값을 최대값에서 최소 강도로 점진적으로 경사시키는 파티클 분석 루틴을 실행합니다. 성공적인 입자 분석을 보장하기 위해, 칼슘 전 과도 클러스터 비 활성, 그리고 가능한 한 많은 칼슘 후 과도 클러스터 비 활성을 통합해야 합니다.
이렇게 하면 신호 대 잡음 비율을 높이는 데 도움이 됩니다. 분석은 플롯 창에 노이즈 플롯으로 그래픽으로 표시되고 미신 창에는 입자 수를 나타내는 녹색 추적, 평균 입자 크기를 나타내는 빨간색 추적 및 절대 강도 임계값을 나타내는 파란색 추적이 있는 세 가지 색상 추적으로 표시됩니다. 히스토그램의 균형을 맞추기 위해 키보드의 입자 노이즈 프레스 H의 플롯을 누릅니다.
그런 다음 오른쪽 브래킷 키를 눌러 배경이 흰색이 될 때까지 색상 구성표를 순환합니다. 측정 도구를 키우려면 키보드에서 한 번 F를 누릅니다. 그런 다음 F를 두 번째로 눌러 색상 플롯이 오른쪽으로 이동하기 시작하는 교차로의 플롯의 추적 창의 스크롤 막대에 하나의 세로 선을 표시합니다.
추적 창 내에서 중간 마우스 버튼을 사용하여 빨간색 추적의 변곡점에서 표시된 흰색 세로 선으로 스크롤합니다. 표시된 Y 평균을 기록한 후 추적 창 내부의 중간 마우스 버튼을 다시 클릭하여 파란색 추적을 선택 해제합니다. 동영상 창에서 C를 클릭하여 색상 휠을 만들고 D를 클릭하여 임계값을 조정합니다.
이제 유효한 파티클이 빨간색으로 표시되고 포화 입자가 흰색으로 표시됩니다. 왼쪽 마우스 버튼을 사용하여 흰색 영역이 제거될 때까지 스크롤하고 중간 마우스 버튼을 사용하여 색상 휠의 노란색 숫자 값을 Y 평균 값으로 조정하여 결정된 임계값지점에서 활성 칼슘 과도 입자로 빨간색으로 모든 것을 할당합니다. STK 3D에 액세스하려면 좌표 기반 파티클 파일로 데이터를 저장하려면 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 파티클 0을 저장하고 왼쪽 단추를 클릭하여 파일을 저장합니다.
파티클 활동 열맵을 만들려면 저장된 파티클 파일을 열고 영화 창에서 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 파티클 STKops, StatMap 플래그에 액세스하고 플래그 할당을 입력하여 분석합니다. 기록 전체의 백분율 발생을 나타내는 다른 색상으로 기록의 전체 길이에 대한 총 입자를 보여주는 분석 및 열 맵을 적용하려면 클릭합니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 열맵을 TIFF 파일로 저장합니다.
그런 다음 동영상 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 파티클 측정값에 액세스하고 파티클 통계 STK가 같으며 분석에 대한 플래그 할당을 입력합니다. 추적 창에서 일련의 추적이 생성됩니다. STM 분석은 공간 확산 및 전파 속도와 같은 칼슘 신호의 공간 특성을 모니터링하고 기록하는 기능을 제공합니다.
이 정보는 그들의 네이티브 환경에서 세포 내의 칼슘 신호 행동의 다소 완전한 보기를 제공하기 위하여 축적될 수 있습니다. 입자 분석을 이용하여 칼슘 신호에 대한 정량적 정보는 입자 영역과 입자 수를 측정하여 계산할 수 있으며, 이는 지정된 시야 내에서 칼슘 신호 활성화의 공간 범위를 결정하는 데 함께 사용될 수 있다. 입자 분석은 또한 칼슘 발사 부위의 위치 및 발사 확률의 검사를 통해 세포 전세포 칼슘 신호의 심층적인 정량화를 허용합니다.
파티클을 측두특성에 따라 다른 플래그에 할당하면 파티클을 정확하게 매핑할 수 있습니다. 그리고 개시 부위의 수에 대해 획득된 풍부한 하드 데이터, 픽셀 및 마이크로미터의 사이트의 크기, 각 칼슘 과도 클러스터 동안 각 개시 부위의 발생 확률, 각 칼슘 과도 클러스터 주기 동안 발생하는 발사 부위의 비율을 얻을 수 있다. 일관성은 이 프로토콜의 성공의 열쇠입니다.
모든 데이터 세트와 모든 동영상은 신뢰할 수 있고 반복 가능한 결과를 보장하기 위해 정확히 동일한 처리되어야 합니다. 이는 파티클 파일을 처리할 때 특히 그렇습니다. 당사의 프로토콜은 앉아서 칼슘 신호의 깊은 특성화를 허용하고, 적절하게 사용될 때 다양한 통계적 방법을 통해 공간 및 측두압 의 범위 간의 차이를 평가할 수 있습니다.
우리의 프로토콜에 있는 이 분석 기술은 연구원이 장 페이스 메이킹및 장 내분및 더 낮은 요로의 신경 통제와 관련있는 이전에 다루기 어려운 질문을 하고 대답하는 것을 허용했습니다.
