通过后染色方法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记RNA的荧光可视化

此处演示的芒果标记凝胶成像方法非常坚固，预计在灵敏度和特异性方面可以简单地扩展。这将进一步简化生物重要RNA和RNA复合物的常规纯化，只需在感兴趣的RNA中加入芒果标签的简单权宜之计。RNA 被牵连到越来越多的疾病中，因为这种后约会方法是一种能够跟踪和可视化RNA的简便而快速的方法。

将凝胶从一个地方转移到另一个地方时需要格外小心，因为凝胶很脆弱，容易断裂。要准备 30 毫升变性凝胶，请首先选择具有适当溴酚蓝色和二甲苯氰醇染料的聚丙烯酰胺百分比，与感兴趣的 RNA 进行比较，以确保高波段分离。然后，根据表 1 混合解决方案 A、B 和 C，并添加 APS 和 timud。

立即将凝胶溶液倒入适当的凝胶铸造装置中。插入所需的圆锥体，将凝胶留在聚合酶中约 30 分钟。使用 1 个 XTBE 溶液制作凝胶罐，并小心地拆下圆锥体。

小心地提起凝胶并安装到凝胶装置上，并使用粘合剂夹固定。使用注射器，在样品装载前立即吸出油井。通过将2X变性凝胶加载溶液加入感兴趣的RNA样品，准备1XRNA样品。

使用热循环器将样品加热 95 摄氏度 5 分钟。然后，使用凝胶加载技巧将冷却样品装载到每个井的底部。以及凝胶在室温下确保功率有效低，不破裂凝胶装置的玻璃板。

根据手稿在干净的玻璃容器中准备 1X 凝胶染色溶液，该容器足够宽，可以舒适地适合凝胶。向容器中加入足够的 1X 凝胶染色溶液，使凝胶在放置在轨道旋转器上时完全覆盖溶液。凝胶完成运行后，从仪器上取出凝胶，切断其"孔"和凝胶的一角，以帮助确定方向。

然后，小心地将凝胶转移到 1X 凝胶染色溶液中。要执行成像，请小心地将染色溶液排掉，然后用水快速冲洗凝胶。最后，小心地将凝胶转移到托盘上，以放置在成像器中。

将玻璃移液器卷到凝胶上，以去除捕获的气泡和多余的液体。然后继续拍摄凝胶图像。芒果一、二、三、四极对变性有实质性的抵制，高达约一个摩尔尿素浓度。

20 至 40 分钟的染色时间足以达到最大凝胶荧光。较长的时间不适合本研究中使用的小RNA，因为它们开始扩散出凝胶。荧光仪分析表明，芒果一、二、三在乌雷亚的存在，其折叠速度比四人更容易。

在没有尿素的情况下，折叠的速度比预期的要快得多。后染色方法的灵敏度由单个波段显示，对应于本地和变性凝胶中每个芒果变体的折叠良好的RNA，对后一种的灵敏度稍低。原生凝胶的定量与芒果一、二、四的线性度比芒果三号更线性。

变性凝胶的定量更线性，表明变性凝胶中存在尿素可能提供一种更均匀的方式，一旦它们被放置在 TO1 生物素染色溶液中，就将其折叠起来。与 SG 染色相比，使用 TO1 生物素染色，在总RNA存在的情况下可以检测芒果标记的RNA。请记住，确保凝胶染色容器足够大，足以容纳凝胶，否则凝胶可能会折叠到自身。

RNA样本将从一个地方转移到另一个地方。与变性凝胶类似，此方法可用于原生凝胶。在较低的功率下在冷室中运行凝胶，以保持原生条件。