RNA有100多个不同的修饰，其中三分之二是甲基化。该协议为对RNA甲基化编写器活性进行灵敏和准确的分析提供了一种方法。这种易于使用的技术使我们能够量化和可视化甲基化RNA，而无需使用抗体，这些抗体通常容易成为伪影。
展示这个程序的将是萨曼莎·谢尔顿，一个来自我实验室的研究生。为了开始这个程序，在1.5毫升的冰上管中设置100微升RNA甲基转移酶测定，如文本协议中所述。将管子漩涡彻底混合，在200倍g下离心5秒钟，收集管底的溶液。
在37摄氏度下孵育管子两小时。然后，使用列纯化清洁反应，如文本协议中所述。要执行液体闪烁计数，请设置闪烁计数机架，每个样品一小瓶，背景测量一小瓶，刷卡测试一小瓶。
用五毫升的闪烁计数溶液填充小瓶。将每个洗洗放射性RNA样品的10微升加入一个小瓶中。拧紧盖子，轻轻混合。
要准备刷卡测试小瓶，请在手术过程中使用的所有表面和设备上彻底擦拭棉签。将这些棉签加入装满闪烁溶液的小瓶中，然后拧紧盖子。要在闪烁计数器上运行样品，请打开计数器罩，将机架插入机器，然后关闭发动机罩。
选择计数单个机架。选择"选择用户程序"。选择或创建一个程序，测量钛60秒，并击中计数机架。
重复闪烁计数三次。在此之后，准备并重新运行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，如文本协议中所述。将20微升放射性RNA材料转移到含有20微升2X凝胶加载缓冲液的1.5毫升管中。
准备梯子后，在70摄氏度下孵育样品15分钟。在样品加载之前，立即将凝胶的孔再次清洗，将缓冲液从凝胶罐向下移液缓冲到凝胶的孔中。然后，将 20 微升的已准备好的梯子、20 微升的样品和 20 微升的 1X 凝胶加载缓冲液加载到凝胶的通道中。
根据聚丙烯酰胺百分比，以 100 伏运行凝胶 60 至 180 分钟。凝胶运行完成后，从盒式磁带上取出凝胶，并将其放在一个装有 50 毫升 1X TBE 缓冲液的盒子里，并含有 5 微升超敏核酸凝胶污渍。在摇杆上孵育五分钟，以染色RNA。
在此之后，小心地将凝胶从包装盒中拿出来，并放在凝胶成像系统的紫外线透光器上，井向上，梯子在左侧。将相机对焦在凝胶上，打开紫外线，然后拍摄凝胶的图像。然后，关闭 UV 曝光，然后将图像另存为 TIFF 文件。
将凝胶放回包装盒中，取出 TBE，并在室温下将凝胶与 50 毫升固定溶液固定在摇杆上 30 分钟。接下来，轻轻地将凝胶移动到一个新鲜的黑盒，其中包含 25 毫升的自造增强溶液。在室温下在摇杆上孵育30分钟。
轻轻提起凝胶，面朝下放在一块塑料包装上，井向上，梯子放在右侧。将两张色谱纸放在凝胶背面，然后翻转整个堆栈。将凝胶干燥机预热至 80 摄氏度。
将凝胶干燥器上的塑料盖移回。将整个堆叠件插入塑料盖下，然后向下移动塑料盖以创建密封件。在80摄氏度下干燥凝胶一小时。
然后，关闭凝胶干燥器，轻轻取出堆叠。取出包装纸和第二色谱纸。将剩余的色谱纸与干凝胶一起用自动放射图盒装上。
在黑暗的房间里，添加一张自摄影胶片。将盒式磁带存放在负 80 摄氏度，并根据信号强度在适当时间开发胶片。一旦薄膜被开发，把它放在盒式磁带的顶部，并使用实验室标记仔细标记凝胶的四个边缘，每个井，以及XC和BB染料的位置。
以每英寸 300 或 600 像素的分辨率扫描胶片，然后将图像另存为 TIFF 文件。在这项研究中，证明一种无抗体的测定可以分析RNA甲基转移酶的活性。与7SK小核RNA的T7RNA聚合酶进行体外转录反应的典型运行显示相对短且结构高的RNA。
有多个不需要的波段，短和长于7SK，可能是由随机转录启动或终止事件引起的。因此，体外转录反应后凝胶纯化对于获得干净的RNA样品非常重要。此时，感兴趣的RNA可以通过相对于梯子的位置来识别，并通过凝胶纯化进行纯化。
此处显示了使用推荐RNA和蛋白质浓度的下限的代表性RNA甲基转移酶测定。此测定允许从闪烁计数的定量结果，以及从自动放射图的定性结果。在这里，一种以甲基酸盐7SK已知的RNA甲基转移酶被证明也能够使甲基六甲酸酯U6。此外，正如最近对7SK所示，组蛋白H4与MPCE的结合也抑制U6甲基化。
这可以在闪烁计数和自动放射图中观察到，显示此协议的鲁棒性。RNA 容易降解，因此请确保使用无 RNase 试剂并彻底清洁所有表面和设备。例如，从这种甲基转移酶测定中获得的放射性标记RNA可以直接用于评估RNA脱乙基酶活性或RNA结合活性。
这种方法允许研究人员测试不同因素对RNA甲基转移酶活性的影响，包括点突变和小分子抑制剂治疗。此方法使用放射性物质，因此请务必佩戴适当的 PPE，在处理和处理放射性物质时要小心。
