DNAAzyme依赖性消化是研究snoRNA功能的有用方法。它是一种快速而简单的方法来分析位点特异性RNA甲基化。它需要一个短的DNA寡核苷酸和基本试剂存在于任何分子生物学实验室。
首先为感兴趣的序列设计 DNAzyme。使用适当的数据库查找RNA序列或甲基化地点。对于 S.cerevisiae snoRNA 目标，请使用酵母斯诺RNA数据库。
要查找感兴趣的甲基化位点，例如，snR13 依赖位点，请选择 snR13 并记下修改后的核苷酸的位置。使用适当的数据库（如糖精基因组数据库）查找修改核苷酸的上下游序列。搜索目标基因名称。
如果使用 10 至 23 DNAzyme 测定，请选择甲基化站点上游和下游的 10 至 15 个核苷酸。如果使用 8-17 DNAzyme，请选择 20 个核苷酸。创建五等和三等臂的互补序列，并使用它们在三等和五等臂的侧翼 DNAzyme 催化序列。
将DNA核苷酸订购为正常的DNA寡核苷酸。在适当的媒介和条件下种植感兴趣的酵母菌株。当细胞达到中指数相时，在4摄氏度下以1000次g的离心进行3分钟，然后丢弃这种介质。
根据手稿指示进行RNA分离。然后，将RNA颗粒重新在30微升的RNase和DNase无水中重新释放。将管子放在冰上，在微光谱光度计上测量RNA浓度。
要使用 10 至 23 DNAzyme 进行 DNAzyme 消化，请用 5 微克 RNA、200 个 10 至 23 DNAAzyme 的皮毛以及总体积为 10 微升的 1-X 10 至 23 孵化缓冲液来准备孵化混合物。然后，将干燥热块上的管子孵育为95摄氏度，三分钟。紧接着，把管子放在冰上，放在冰上，放在冰上五分钟。
简单地旋转管子，把它们放回冰上。加入20个单位的RNase抑制剂，并将管子放在25摄氏度的干热块上10分钟。同时，将5微升4-X 10至23反应缓冲液与4微升300摩尔氯化镁和1微升水相结合，准备反应混合物。
在设置为 37 摄氏度的干热块上预热此反应混合物。将带孵化混合物的管子放在37摄氏度的干热块上，并加入10微升的预预热反应混合物。在37摄氏度下孵育混合物一小时，然后将管子放在冰上。
要使用 8-17 DNAzyme 进行 DNAzyme 消化，请准备一个 1.5 毫升微管，总体积为 6 微升，内有 5 微克RNA。然后，准备一个单独的管与400图片的8-17DNAzyme。工作时，将两根管子都放在冰上。
将两根管子转移到设置为 95 摄氏度的干热块中，并孵育两分钟。将RNA样品移回冰上，用DNAzyme旋转下管5秒钟。在25摄氏度下孵育DNAzyme10分钟。
当DNAzyme孵育时，准备10个2-X 8-17反应缓冲液，并预热至25摄氏度。将预预热缓冲液与DNAzyme一起加入到管中，然后，将这种反应混合物的14微升与RNA一起转移到管中，以及20个单位的RNase抑制剂。在25摄氏度下孵育反应两小时，然后将管子放在冰上。
为了在DNAAzyme消化后净化RNA，在反应管中加入350微升水和400微升氯仿。涡流30秒，以20，000倍g离心5分钟。离心后，将上相转移到含有1毫升乙醇、40微升7.5-5-5-0.5-醋酸铵和1微升糖原的新管中。
翻转管子几次混合和孵育在负80摄氏度两个小时或负20摄氏度过夜。根据手稿指示进行RNA纯化，然后将RNA颗粒重新悬浮在10微升RNase和无DNase水中。净化后立即将RNA管放在冰上。
要进行RNA电泳，首先在127.5毫升的双蒸馏水中溶解1.5克阿加罗斯，在微波炉中加热混合物。然后，在甲糖溶液中加入15毫升10倍的莫美和7.5毫升的37%甲醛。在红糖溶液中加入适当数量的凝胶污渍。
将加糖倒入托盘中，冷却45分钟。通过将消化和纯化的RNA的10微升与5个微升的样品变性缓冲液和0.5微升的六-X载荷染料相结合，准备RNA样品。在70摄氏度下孵育样品5分钟，然后在冰上孵育5分钟。
将准备好的凝胶放入电泳罐中，用一 X MOPS 缓冲液填充罐体。将样品的整个 15 微升加载到凝胶上，以 80 伏电压运行凝胶，直到溴化醇蓝色达到凝胶长度的 2/3。使用适当的成像器分析凝胶。
该技术的价值可以在可教育的 snoRNA 转录系统上得到证明。在snR13或snR47基因的上游插入一个可受诱惑的GAL1启动子，可以分析25S核糖体RNA的斯诺RNA依赖甲基化。当细胞生长在乳糖上时，25S核糖体RNA在snoRNA引导位点被甲基化，在DNAzyme治疗后保持不变。
相比之下，当SnoRNA表达因缺乏全麦糖而关闭时，DNAzyme依赖性裂解发生。此外，在野生类型对控中未观察到RNA消化，因为snoRNA表达与半乳糖无关。DNAzyme依赖性裂解在分析我们的rRNA修饰中的活性最近在SnoRNA成熟的背景下得到了证明。
DNAzyme依赖性测定用于表明，缺乏五等和预 snoRNA 处理会影响 25S 和 18S rRNA 的甲基化水平。该协议要求使用苯酚和氯仿，这是有毒的，应在烟罩下处理。
