ここで示す Mango タグ付きゲルイメージング方法論は堅牢であり、感度と特異性の点で簡単に拡張できることが期待されています。これは、目的のRNAにマンゴータグを追加するという単純な便宜によって、生物学的に重要なRNAおよびRNA複合体の日常的な精製をさらに簡素化するであろう。RNAは、このポストデート法のためにますます多くの病気に関与しており、RNAを追跡し、視覚化するための簡単かつ迅速な方法です。
ゲルは壊れやすく、壊れやすいので、ゲルをある場所から別の場所に移す際には、特別な注意が必要です。30ミリリットル変性ゲルを調製するために、まず適当なブロモフェノールブルーでポリアクリルアミドの割合を選択し、キシレンシアノール染料を高帯域分離を保証するために目的のRNAと比較して。次に、表 1 に従ってソリューション A、B、および C を混合し、APS と timud を追加します。
すぐに適切なゲル鋳造装置にゲル溶液を注ぎます。目的のコーンを挿入し、ゲルをポリメラーゼに約30分間放置します。1 XTBE溶液を使用してゲルタンクを作り、慎重にコーンを取り外します。
ゲルを慎重に持ち上げてゲル装置に取り付け、バインダークリップを使用して固定します。注射器を使用して、サンプルローディングの直前に井戸を吸引する。目的のRNAサンプルに2X変性ゲルローディング溶液を添加して1X RNAサンプルを調製します。
サーモサイクラーを使用して、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、ゲルローディングチップを使用して冷却したサンプルを各ウェルの底部にロードします。そして、ゲルを室温で良好にし、ゲル装置のガラス板を割らないで電力が効果的に低い。
ゲルに快適にフィットできるほど広いきれいなガラス容器に原稿に従って1Xゲル染色液を調製します。十分な1倍のゲル染色液を容器に加えて、周回回転器に置いたときにゲルが溶液で完全に覆われるようにします。ゲルの実行が終了したら、ゲルを装置から取り出し、そのウェルとゲルの角を切り落とし、向きを決定します。
次に、ゲルを1Xゲル染色液に慎重に移します。イメージングを行うために、染色液を慎重にデカントし、ゲルを水で素早くすすいすます。最後に、慎重にイメージャーに置かれるトレイにゲルを移します。
閉じ込められた気泡と余分な液体を除去するためにゲルの上にガラスピペットを転がします。そしてゲル画像の撮影に進みます。マンゴーアプタマー1、2、3、4は、ほぼ1モル尿素濃度までの変性に実質的に抵抗した。
20〜40分の染色時間は、最大ゲル蛍光に十分であった。より長い時間は、ゲルから拡散し始めたため、この研究で使用される小さなRNAには適していなかった。フルオロメーター分析は、尿素の存在下でマンゴーアプタマー1、2、および3がアプタマー4よりも速く折り畳むことができることを示した。
尿素の不在時には、折り畳みは予想通りはるかに速かった。ポスト染色法の感度は、後者のゲルに対する感度がわずかに少ないネイティブおよび変性ゲルのマンゴーバリアントのそれぞれについて、よく折りたたまれたRNAに対応する単一のバンドによって示された。ネイティブゲルの定量化は、マンゴー1、2、および4がマンゴー3よりも直線的に振る舞う約1桁の程度の程度の丸直性であった。
変性ゲルの定量化は、変性ゲル中の尿素の存在がTO1ビオチン染色溶液に入れられた後、アプタマーを折り畳むより均質な方法を提供するかもしれないことを示唆するより直線的であった。マンゴータグ付きRNAは、SG染色と比較してTO1ビオチン染色を使用して全RNAの存在下で検出することができる。ゲル染色容器がゲルに合うほどの大きさであることを確認してください。
RNAサンプルは、ある場所から別の場所に移動します。変性ゲルと同様に、この方法は、天然ゲルに対して行うことができる。ネイティブ条件を維持するために、低ワット数の冷たい部屋でゲルを実行します。
