在这里，我们提出了我们简单的协议，用于在分节材料上的蛋白质上进行免疫荧光检测。此方法不需要抗原检索。我们将使用鼠标头，包括未计算硬组织。
该技术的主要优点是跳过硬组织抗原检索和脱钙。这些导致免疫污染效果的质量良好。这种方法还节省了时间和人工。
此方法也适用于其他组织，并适当修改。为了从未计算的组织中制作好部分，进一步解剖目标组织以修剪周围的组织，如有必要，在低温保护前两天，在四摄氏度下用 10%EDTA 处理样品。可视化演示对该方法的过程进行了详细而清晰的说明。
首先，为每只怀孕小鼠准备一个10厘米和几个3.5厘米的含有PBS的盘子和一个含有两毫升4%PFA的培养板，每个井内都有4%PFA的培养板，并把它们全部放在冰上。要解剖怀孕小鼠的胚胎，用钳子抓住安乐死小鼠腹部中心下方的皮肤，只切开皮肤，然后轻轻拉皮，将其从下腹部肌肉壁分离。按照相同的皮肤切口线，切入腹腔。
取出含有一串胚胎的子宫。然后，通过轻轻切开子宫壁来去除胚胎，子宫壁将去除外质组织，如蛋黄囊和安尼翁。切割并分离头部，从每个胚胎，用钳子将每个头部转移到一个包含4%PFA的12井板的单独井中。
在四摄氏度下孵育四小时以修复。在 4 摄氏度的 PBS 中冲洗头部，轻轻摇动 12 小时。要冷冻保护头部，请用钳子将其转移到新的 12 井板中，其中含有 PBS 中 30%蔗糖的两毫升。
在四摄氏度下轻轻的搅拌孵育，直到头部沉入菜底。要嵌入低温保护头，请将它们转移到含有最佳切割温度化合物的模具中，并平衡几分钟。使用钳子，调整样品的位置和方向，使样品的修剪侧朝向嵌入模具的底部。
然后，将模具放在干冰上进行冷冻，并存放在零下80摄氏度的塑料袋中，直到准备进行冷冻。对于产后组织，在切除安乐死三周至三个月大的小鼠的皮肤和脂肪组织后，切开并隔离头部，取出粘结物。然后，修复和冷冻保护头部，就像用胚胎头做。
以与 OCT 中的胚胎头类似的方式嵌入 8% 明胶中，并将 Cryomolds 放在零下 80 摄氏度的塑料袋中，直到冷冻。设置适当的低温恒温。将样品放在低温室中约 30 分钟，以与低温恒温均衡。
将带样品的块从 Cryomold 中拆下，然后用 OCT 滴将其安装到试样夹头上并冻结，确保样品的修剪侧远离夹头并朝向操作员。将块安装夹头装载到低温器对象支架上。调整刀片支架，使铲刀角度相对于样品保持 3 到 5 度。
将 10 微米部分收集到涂层显微镜幻灯片上。将部分留在室温下，直到完全干燥，然后将它们储存在零下80摄氏度。首先进行染色，从零下80摄氏度的零下80摄氏度中拿出滑梯，并在室温下保持一小时，以空气干燥部分。
在0.1%PBST中冲洗幻灯片三次，每次五分钟，洗净十进制，并渗透部分。在每个幻灯片中加入 200 微升的阻消溶液，并在室温下孵育 30 分钟。然后，在不冲洗幻灯片的情况下移除阻塞解决方案。
在每张幻灯片中加入100微升的原抗体稀释，并在4摄氏度下孵育。在室温下，用 PBS 冲洗幻灯片三次，每次冲洗 10 分钟。加入100微升的二次抗体稀释在阻消溶液中，并在室温下孵育一小时，免受光线影响。
在室温下用PBS冲洗三次，每次冲洗10分钟，仍然防止光线。要安装幻灯片，请在每张幻灯片上添加两滴带 DAPI 的防褪色介质，盖上盖玻片，并在 4 摄氏度下存储，直到准备好成像。控制胚胎的正面骨骼对pSmad1/5/9、下游BMP信号因子和细胞增殖标记Ki67呈阳性。
然而，在神经波峰特异性，组成激活BMPR1A突变胚胎，然而，pSmad1/5/9水平增加，而Ki67水平下降。此外，在突变胚胎的正面骨骼中观察到的凋亡细胞比控制胚胎的细胞多。明胶嵌入头部的冠状冷冻清晰显示来自鼻骨和鼻组织tdTomato盒的GFP信号和RFP信号，表明明胶不会干扰荧光信号。
当这些部分被免疫污为SOX9或Osterix和E11/波多普兰素，优质部分从大多数三个星期的硬组织获得。另一方面，用三个月大的样本，只在一些硬组织，包括股骨、鼻组织和头骨的血管隔间，包括鼻腔缝合线和头部周围的骨头中，只获得了高质量的部分。SOX9阳性细胞特别在生长板的软骨细胞和股骨和鼻隔膜的关节中检测。
在三周大的切口中，SOX9在分血细胞中被发现。奥斯特里克斯和E11双染色结果表明，在骨细胞中检测到奥斯特里克斯，而E11在股骨和头部骨骼的骨细胞中检测到。在三周的切口中，奥斯特利克斯在细胞质中呈阳性，而E11在卵泡中质细胞中呈阳性。
请不要用 4%PFA 过度修复样品。对于未计算硬组织在明胶中的分块，最佳温度为零下25摄氏度，更低。按照这个程序，荧光水平可以量化，如我们的协议中描述的。
这些测量将提供翔实的数据，以显示不同组之间蛋白质相对水平的差异。在它的发展之后，这项技术为双重或三重染色铺平了道路，以获得不同蛋白质的共表达模式。4%PFA 是危险的。
它可能导致皮肤过敏、严重眼损伤、器官损伤或癌症。请使用个人防护设备，处理后彻底清洗皮肤。
