Здесь мы представляем наш простой протокол для обнаружения иммунофлуоресценции на белках на секционных материалах. Этот метод не требует поиска антигена. Мы будем использовать мышиные головки, в том числе неутященные твердые ткани.
Основным преимуществом этого метода является пропуск поиска антигена и декалькации твердых тканей. Это приводит к хорошему качеству иммуностимуляторных результатов. Этот метод также экономит время и труд.
Этот метод также применим к другим тканям с соответствующими модификациями. Чтобы сделать хорошие разделы из неутязвимых тканей, вскрыть ткани мишени дальше обрезать окружающие ткани, и при необходимости лечить образцы с 10%EDTA при четырех градусах по Цельсию в течение двух дней до криопротекции. Визуальная демонстрация дает подробное и четкое объяснение процедуры этого метода.
Для начала приготовьте одну 10-сантиметровую и несколько 3,5-сантиметровых блюд, содержащих PBS, и одну культурную тарелку из 12 колодец, содержащую два миллилитров по 4%PFA в PBS в каждом колодеце для каждой беременной мыши, и поместите их все на лед. Чтобы вскрыть эмбрионы от беременных мышей, возьмите кожу ниже центра живота усыпленной мыши с мибрами, прорезать только кожу, а затем осторожно потяните на кожу, чтобы отделить ее от основной стенки мышц живота. Следуя той же линии разреза кожи, нарезать брюшную полость.
Удалите матку, содержащую вереницу эмбрионов. Затем удалите эмбрионы, аккуратно отрезав стенку матки, которая уберет экстраэмбрионные ткани, такие как желточный мешок и амнион. Вырезать и изолировать голову от каждого эмбриона, и с типсами передачи каждой головы в отдельный колодец 12-хорошо пластины, содержащей 4%PFA.
Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение четырех часов, чтобы исправить. Промыть головы в PBS при четырех градусах по Цельсию с нежной тряской в течение 12 часов. Чтобы криопротезть головы, перенесите их с помощью типсов в новую пластину из 12 колодец, содержащую два миллилитров 30%-ую сахарозу в PBS.
Инкубировать с нежным возбуждением при четырех градусах по Цельсию, пока головы опускаются на дно блюда. Чтобы встроить криопротекторные головки, перенесите их в форму, содержащую оптимальное температурное соединение резки, и эквилибрат в течение нескольких минут. Используя типсы, отрегулируйте расположение и направление образцов так, чтобы обрезанная сторона образцов была расположена в нижней части встраиваемой формы.
Затем поместите плесень на сухой лед, чтобы заморозить, и хранить в полиэтиленовом пакете при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к криозиции. Для послеродовой ткани, после удаления кожи и жировой ткани усыпляемой, трехнедельной до трехмесячной мыши, вырезать и изолировать голову и удалить челюсти. Затем, исправить и криопротекторной головы, как это делается с эмбрионом головы.
Вставлять в 8%gelatin таким же образом, как эмбрион головы в OCT, и держать Cryomolds в полиэтиленовый пакет при температуре минус 80 градусов по Цельсию до криозирования. Установите соответствующую температуру криостата. Поместите образцы в криостатической камере в течение примерно 30 минут, чтобы уравночные до криостата температуры.
Удалите блок с образцом из Cryomold, и смонтировать его с OCT падение на образец патрон и заморозить его, убедившись, что держать подстриженной стороне образца дальше от патрона и перед оператором. Загрузите блок-монтажный патрон на держателя объекта криостата. Отрегулируйте держатель лезвия так, чтобы угол лезвия был от трех до пяти градусов по отношению к образцу.
Соберите 10-микрометровые секции на покрытые микроскопом слайды. Оставьте секции при комнатной температуре до полного высыхания, а затем храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для начала окрашивание вынул горки от минус 80 градусов по Цельсию, и держать их при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы высушить секции.
Промыть слайды в 0,1%PBST три раза в течение пяти минут каждый, чтобы вымыть OCT и пронизать разделы. Добавьте 200 микролитров блокирующего раствора к каждому слайду и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем удалите блокирующий раствор, не полоская слайд.
Добавьте 100 микролитров первичных антител, разбавленных в блокирующий раствор для каждого слайда, и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. Промыть горки с PBS три раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров вторичных антител, разбавленных блокирующим раствором, и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света.
Промыть в PBS три раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, по-прежнему защищены от света. Чтобы смонтировать слайды, добавьте две капли антиутухой среды с DAPI на каждом слайде, накройте крышкой и храните при четырех градусах Цельсия до готовности к изображению. Фронтальные кости контрольных эмбрионов были положительными для pSmad1/5/9, ниже по течению BMP сигнальных факторов, и Ki67, маркер пролиферации клеток.
Однако в нейронных эмбрионах-мутантах, активированных в составе BMPR1A, уровни pSmad1/5/9 были увеличены, в то время как уровни Ki67 были снижены. Кроме того, в лобных костях эмбрионов мутантов наблюдалось больше апоптотических клеток, чем у контрольных эмбрионов. Корональные криозы головки, встроенные в желатин, ясно показывают сигнал GFP и сигнал RFP из кассеты tdTomato в носовой кости и носовых тканях, демонстрируя, что желатин не мешает флуоресцентным сигналам.
Когда эти разделы были иммунотеминированы для SOX9 или Osterix и E11/Podoplanin, качественные секции были получены из большинства трехнедельных твердых тканей. С другой стороны, с трехмесячных образцов, хорошего качества разделы были получены только в некоторых из твердых тканей, в том числе трабекулярных отсеков бедренной кости, носовых тканей и черепа, в том числе носовой премаксилла шва и окружающих костей головы. SOX9-положительные клетки были обнаружены именно в хондроцитах пластины роста и суставах из бедренной кости и носовой перегородки.
В трехнедельном резцаторе SOX9 был обнаружен в мезенхимальных клетках. Остерикс и E11 двойное окрашивание результаты показывают, что Osterix был обнаружен в остеобласты, в то время как E11 был обнаружен в остеоцитов костей из бедренной кости и головы. В трехнедельном резцаторе, Osterix был положительным в odontoblasts, в то время как E11 был положительным в фолликула мезенхимальных клеток.
Пожалуйста, не переиммите образцы с 4%PFA. Для сеяния неутященных твердых тканей в желатине лучшая температура составляет минус 25 градусов по Цельсию и ниже. После этой процедуры уровни флуоресценции могут быть количественно определены, как описано в нашем протоколе.
Эти измерения будут предоставлять информативные данные, чтобы показать разницу относительного уровня белка между различными группами. После его развития, этот метод проложил путь для двойного или тройного окрашивания, чтобы получить совместное выражение моделей различных белков. 4%PFA является опасным.
Это может вызвать аллергию на кожу, серьезные повреждения глаз, повреждения органов, или рак. Пожалуйста, используйте средства индивидуальной защиты, и мыть кожу тщательно после обработки.
