כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הפשוט שלנו לגילוי שפעת חיסונית על חלבונים על חומרים חתויקים. שיטה זו אינה דורשת אחזור אנטיגן. נשתמש בראשי עכבר, כולל רקמות קשות לא מחושבות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לדלג על אחזור אנטיגן ו decalcification של רקמות קשות. אלה מובילים לאיכות טובה של תוצאות immunostaining. שיטה זו גם חוסכת זמן וגם עבודה.
שיטה זו חלה גם על רקמות אחרות עם שינויים מתאימים. כדי להפוך חלקים נחמדים מרקמות לא מחושבות, לנתח את רקמת היעד שלך עוד יותר לקצץ את הרקמות שמסביב, ובהכרח לטפל בדגימות עם 10% EDTA בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני cryoprotection. הדגמה חזותית מספקת הסבר מפורט וברור של ההליך של שיטה זו.
כדי להתחיל, הכינו מנות אחד באורך 10 ס"מ וכמה מנות באורך 3.5 ס"מ המכילות PBS וצלחת תרבות אחת בת 12 בארות המכילה שני מיליליטר של 4%PFA ב-PBS בכל באר עבור כל עכבר בהריון, והמקמו את כולם על קרח. כדי לנתח עוברים מעכברים בהריון, לתפוס את העור מתחת למרכז הבטן של עכבר המתת לחץ עם מטלות, לחתוך דרך העור בלבד, ולאחר מכן בעדינות למשוך את העור כדי להפריד אותו מקיר שריר הבטן הבסיסית. בעקבות אותו קו של חתך העור, לחתוך לתוך חלל הבטן.
הסר את הרחם המכיל מחרוזת של עוברים. לאחר מכן, להסיר את העוברים על ידי חיתוך בעדינות את קיר הרחם, אשר יסיר את הרקמות extraembryonic כגון החלמון sac ו amnion. חותכים ומבודדים את הראש מכל עובר, ועם מדפים מעבירים כל ראש לתוך באר נפרדת של צלחת 12 באר המכילה 4% PFA.
דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות כדי לתקן. שוטפים את הראשים ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות במשך 12 שעות. כדי ל Cryoprotect את הראשים, להעביר אותם באמצעות מדפים לתוך צלחת חדשה 12 באר המכיל שני מיליליטר של 30% סוכרוז PBS.
דגירה עם תסיסה עדינה בארבע מעלות צלזיוס עד שהראשים שוקעים לתחתית המנה. כדי להטמיע את הראשים cryoprotected, להעביר אותם לתוך תבנית המכילה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, ו לצייד במשך כמה דקות. באמצעות מדפים, להתאים את המיקום והכיוון של הדגימות, כך הצד החתוך של הדגימות פונה לתחתית התבנית הטבעה.
לאחר מכן, מניחים את התבנית על קרח יבש להקפיא, ולאחסן בשקית ניילון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן cryosectioning. עבור רקמת לאחר הלידה, לאחר הסרת העור ורקמות השומן של עכבר המתת דם, שלושה שבועות עד שלושה חודשים, לחתוך ולבודד את הראש ולהסיר את הדם. לאחר מכן, לתקן cryoprotect את הראש כפי שנעשה עם ראשי עובר.
להטמיע 8% ג'לטין באופן דומה כמו ראשי עוברים OCT, ולשמור Cryomolds בשקית ניילון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד קריוסקופיה. הגדר את טמפרטורת ההקפאה המתאימה. מניחים את הדגימות בתא ההקפאה במשך כ -30 דקות כדי לצייד לטמפרטורת ההקפאה.
הסר את הבלוק עם הדגימה מן Cryomold, ולהוות אותו עם טיפת OCT על צ'אק הדגימה ולהקפיא אותו, הקפד לשמור על הצד הגזוז של המדגם הרחוק ביותר מן צ'אק מול המפעיל. טען את הצ'אק רכוב על הבלוק על מחזיק אובייקט ההקפאה. כוונן את מחזיק הלהב כך שזווית הלהב היא שלוש עד חמש מעלות יחסית לדגימה.
אסוף מקטעי 10 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ מצופות. השאירו את החלקים בטמפרטורת החדר עד יבש לחלוטין, ולאחר מכן לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל עם הכתמים, להוציא שקופיות מינוס 80 מעלות צלזיוס, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר במשך שעה כדי לייבש את החלקים באוויר.
שטפו את השקופיות ב-0.1%PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת כדי לשטוף את OCT ולחלחל למקטעים. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לכל שקופית, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את פתרון החסימה מבלי לשטוף את השקופית.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני מדולל בתת פתרון חסימה לכל שקופית, ומדגרים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של נוגדנים משניים מדוללים בתת פתרון חסימה, ומדגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור.
יש לשטוף ב-PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר, שעדיין מוגנת מפני אור. כדי לטעון את השקופיות, הוסף שתי טיפות של אמצעי נגד עמעום עם DAPI בכל שקופית, לכסות עם כיסוי ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לתמונה. עצמות קדמיות של עוברי בקרה היו חיוביות עבור pSmad1/5/9, גורמי איתות BMP במורד הזרם, ו- Ki67, סמן התפשטות תאים.
בעוברים מוטנטים BMPR1A המופעלים באופן בלתי הפיך, עם זאת, רמות pSmad1/5/9 הוגדלו בעוד רמות Ki67 ירדו. יתר על כן, תאים אפטוטיים יותר נצפו בעצמות הקדמיות של עוברים מוטנטים מאשר אלה של עוברי שליטה. קריוסקציות קורונאליות של ראשים משובצים בג'לטין מראות בבירור אות GFP ואות RFP מקלטת tdTomato בעצם האף ורקמות האף, המוכיחות כי ג'לטין אינו מפריע לאותות פלואורסצנטיים.
כאשר חלקים אלה היו immunostained עבור SOX9 או Osterix ו E11/Podoplanin, חלקים באיכות טובה התקבלו מרוב הרקמות הקשות של שלושה שבועות. מצד שני, עם דגימות של שלושה חודשים, חלקים באיכות טובה הושגו רק בחלק מהרקמות הקשות, כולל התאים הטרביקיו של עצם הירך, רקמות האף והגולגולת, כולל תפר האף-premaxilla ועצמות הסובבות את הראש. תאים חיוביים SOX9 זוהו במיוחד chondrocytes של צלחת הצמיחה ואת המפרק מעצם הירך ואת מחיצת האף.
בחתך בן שלושה שבועות, SOX9 זוהה בתאי mesenchymal. תוצאות הכתמים הכפולים של Osterix ו- E11 מראות כי אוסטריקס זוהה באוסטיובלסטים, בעוד E11 זוהה באוסטיוציטים של עצמות מעצם הירך והראש. בחתך של שלושה שבועות, אוסטריקס היה חיובי ב odontoblasts, בעוד E11 היה חיובי בתאי mesenchymal זקיק.
נא אל תפיק עודפי דוגמאות עם 4%PFA. עבור חתך של רקמות קשות לא מחושבות בג'לטין, הטמפרטורה הטובה ביותר היא מינוס 25 מעלות צלזיוס ומורידה. בעקבות הליך זה, ניתן לכמת רמות פלואורסצנטיות כמתואר בפרוטוקול שלנו.
מדידות אלה יספקו נתונים אינפורמטיביים כדי להראות את ההבדל של הרמה היחסית של חלבון בין קבוצות שונות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לכתמים כפולים או משולשים כדי לקבל דפוסי ביטוי שותף של חלבונים שונים. 4%PFA הוא מסוכן.
זה עלול לגרום לאלרגיות בעור, נזק חמור לעיניים, נזקים לאיברים, או סרטן. אנא השתמשו בציוד מגן אישי, ושטפו את העור ביסודיות לאחר הטיפול.
