分离叶测定,以简化马铃薯中基因表达研究,在咀嚼昆虫曼杜卡性塔感染

该协议使用一种简化的方法测量植物基因表达，以回应昆虫食草。通过使用在培养皿中分离的分离叶，昆虫在相对较短的侵扰期更容易应用和监测，有助于可重现的基因表达数据。该协议可能适用于许多植物/昆虫相互作用。

如果考虑来自整个工厂系统的基线观测值。昆虫喂养的不可预知性可能具有挑战性。因此，可靠的适当阶段性幼虫和健康植物的供应提供了最好的成功机会。

可视化健康的植物和昆虫应该如何出现和行为有助于实现最佳结果，尤其是对于新到研究领域的研究人员。与我展示这个程序的将是弗朗西斯·佩雷斯，一个分子生物学家在水果和蔬菜实验室的基因改进。为了准备节点繁殖组织培养马铃薯植物，首先获得从种植材料中生长的Kennebec植物，至少有三到四个节点。

使用无菌刀片去除切割靠近主茎的树枝的叶子，每片留下大约两毫米的枝组织。每个节点上方和下方切割约两毫米，以去除茎上的节点部分，并在含有节点转移介质的无菌组织培养容器中排列节点切口，分支指向上方。然后将节点切割转移到植物组织培养室，在24摄氏度下生长两到三周，并形成16小时光，8小时黑暗照期。

为准备昆虫喂养，获得M.sexta所需的幼虫阶段，并根据幼虫的大小将一个幼虫转移到适当密封容器的每个井中。使用五个坚固的托盘，使用五个坚固的托盘，使用五个坚固的托盘，使用五个大小合适的培养皿，用白纸衬里制作放置模板。使用每个纸盒中纸张上适当大小的 Petri 盘跟踪一组六个圆圈，并标记一组控制 A、B 和 C 的圆圈，以及其他受感染的 A、B 和 C。然后用适当的收获时间标记每个放置模板。

接下来，在放置模板中为每个圆标一个1.7毫升的微离心管，以适当识别扰动、植物复制信和收获时间点。当所有管子都贴有标签后，将无菌滤纸盘放入每个模板的一个培养盘中，用无菌水润湿光盘，而不会让每个盘内多余的液体池。然后在每个放置模板中放入每个圆圈中放置一个菜，并在每个放置模板旁边放置三个相同年龄和相对大小的马铃薯植物。

要启动侵扰，请使用无菌剪刀从每种植物中去除前两个大小匹配的叶子，并尽快将一片叶子放在控制培养皿中，并在受感染的培养皿中放置一片。当所有叶子都放置后，使用柔软的触摸钳子，将至少一个幼虫尽快转移到每个受感染的盘中，并设置所需出虫时间的定时器。观察喂养，以确保所有幼虫都在吃，必要时更换任何非喂养的幼虫。

在侵扰时间结束时从所有叶子上去除所有幼虫，然后启动收获计时器。在每个收获时间点结束时，将每片叶子转移到相应的管中，并立即将管子放入液氮中，在零下80摄氏度储存叶样品之前冷冻，直到RNA分离。健康准确分阶段的幼虫应在放置在叶子表面后立即开始喂养，在整个侵扰期间，喂养应以相当一致的方式继续。

这种叶子底部的幼虫没有消耗任何植物材料，是一个不成功的侵扰的例子。这些叶子与两周大的节点繁殖组织培养植物分离，每个幼虫阶段以不同的速率和喂养方式食用。根据这些结果，选择第四个星幼虫，以进一步评估对更成熟的土壤种植马铃薯植物的叶子的损害，这些植物的土壤生长更接近田间种植的马铃薯植物。

在这些基因表达研究中，确定了两个新的C2H2锌手指转录因子，这些因子对M.sexta食草动物有强有力的反应，支持使用分离叶进行侵扰性检测。请记住，使用年龄和大小匹配的叶子，并正确地阶段每个实验的幼虫作为均匀性导致更可重复的数据。叶组织可以检测为压力感应活性氧物种和茉莉花酸激素衍生物。

整个转录组、蛋白质组或微生物组研究也可以在叶组织上进行。