Bu protokol, böcek otunu ile karşılık olarak bitki gen ekspresyonunu ölçmek için aerodinamik bir yaklaşım kullanır. Petri kaplarında izole edilmiş müstakil yapraklar kullanılarak, böceklerin tekrarlanabilir gen ekspresyonu verilerine katkıda bulunan nispeten kısa istila döneminde uygulanması ve izlenmesi daha kolaydır. Bu protokol birçok bitki/böcek etkileşimine uyarlanabilir.
tüm tesis sistemlerinden temel gözlemler dikkate alınırsa. Böcek beslemenin öngörülemeyen doğası zor olabilir. Bu nedenle, düzgün sahnelenen larvalar ve sağlıklı bitkilerin güvenilir bir kaynağı başarı en iyi şansı sağlar.
Sağlıklı bitkilerin ve böceklerin nasıl görünmesi ve nasıl görünmesi gerektiğini görselleştirmek, özellikle çalışma alanında yeni araştırmacılar için en iyi sonuçları elde etmek için etkilidir. Prosedürü benimle birlikte gösteren frances Perez, meyve ve sebze laboratuvarının genetik gelişiminde moleküler biyolog olacak. Nodal yayılan doku kültürü patates bitkileri hazırlamak için, ilk en az üç ila dört düğümile eksplant malzemeden yetiştirilen Kennebec plantesiyonlar elde.
Ana sapyakın dalları kesme ve yaprak başına dal dokusu yaklaşık iki milimetre bırakarak yaprakları kaldırmak için steril bir bıçak kullanın. Gövdelerden nodal kesitleri çıkarmak ve dal yukarı işaret eden nodal transfer ortamı içeren steril doku kültür kabında nodal kesimleri düzenlemek için her düğümün yaklaşık iki milimetre yukarısını ve altında kesin. Daha sonra nodal kesimleri 24 santigrat derecede 2-3 haftalık bir büyüme ve 16 saatlik ışık, sekiz saatlik karanlık fotoğraf çekimi için bir bitki doku kültür odasına aktarın.
Böcekleri beslenmeye hazırlamak için, M.sexta'nın istenilen larva evresini elde edin ve larvanın büyüklüğüne göre uygun bir çevreleme kabının her kuyusuna bir larva aktarın. Beyaz kağıtla kaplı altı uygun büyüklüktePetri yemeği bir dizi tutma yeteneğine sahip beş sağlam tepsiler kullanarak her hasat zaman noktası için yerleştirme şablonları olun. Her tepsideki kağıt üzerinde uygun büyüklükteki Petri kabını kullanarak altı daireden oluşan bir setiz ve a, b ve c ve diğer istila edilmiş A, B ve C.'yi kontrol eden bir daire kümesini etiketleyin ve her yerleşim şablonuna uygun hasat süresiyle etiketleyin.
Daha sonra, uygun pertürbation, bitki çoğaltma mektubu ve hasat zaman noktası tanımlamak için yerleştirme şablonundaki her daire için bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp etiket. Tüm tüpler etiketlendiğinde, şablon başına bir Petri kabına steril filtre kağıdı disk yerleştirin ve her kapta fazla sıvı havuzuna izin vermeden diskleri steril suyla nemlendirin. Sonra her yerleşim şablonunda her daire içine bir çanak yerleştirin ve her yerleşim şablonu yanında aynı yaş ve göreceli boyutta üç patates bitkileri yerleştirin.
Istilayı başlatmak için, her bitkiden en üstteki iki boy eşleşen yaprakları çıkarmak için steril makas kullanın ve her bitki için en kısa sürede bir yaprağı kontrol Petri kabına ve bir yaprağı da istila edilmiş Petri kabına yerleştirin. Tüm yapraklar yerleştirildiğinde, en az bir larvayı en kısa sürede her istila yakarışın içine aktarmak ve istenilen istila süresi için zamanlayıcıyı ayarlamak için yumuşak dokunma forsepsleri kullanın. Tüm larvaların yediğinden emin olmak için beslenmeyi gözlemleyin, gerektiğinde beslenmeyen larvaları değiştirin.
Istila süresinin sonunda tüm yaprakların tüm larvaları çıkarın ve hasat için zamanlayıcı başlatın. Her hasat zaman noktasının sonunda, her yaprağı ilgili tüpe aktarın ve rna izolasyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede depolanmadan önce yaprak örneğini dondurmak için tüpü hemen sıvı nitrojene bırakın. Sağlıklı ve doğru şekilde sahnelenmiş larvalar yaprak yüzeyine yerleştirildikten hemen sonra beslenmeye başlamalı ve beslenme istila süresi boyunca oldukça tutarlı bir şekilde devam etmelidir.
Bu yaprağın altındaki larva herhangi bir bitki materyali tüketmedi ve başarısız bir istilaya bir örnektir. Bu yapraklar iki haftalık nodal yayılan doku kültür bitkilerinden ayrılmış ve her larva evresi için farklı oranlarda ve beslenme stillerinde tüketildi. Bu sonuçlara dayanarak, dördüncü instar larvaları daha da daha yakın alan yetiştirilen patates bitkileri yaklaşık daha olgun toprak yetiştirilen patates bitkileri için yaprakların zarar değerlendirmek için seçildi.
Bu gen ekspresyonu çalışmalarında, M.sexta otunu sağlam bir şekilde yanıt veren iki yeni C2H2 çinko parmak transkripsiyon faktörü, istila tahlillerinde müstakil yaprakların kullanımını destekleyen tanımlanmıştır. Yaş ve boyut eşleşen yaprakları kullanmayı unutmayın ve düzgün her deneme için larvaları düzgün sahnelemek için tekdüzelik daha çoğaltılabilir veri sonuçları olarak. Yaprak dokuları stres etekli reaktif oksijen türleri ve jasmonik asit hormonu türevleri için teşite edilebilir.
Tüm transkripsiyon, proteom veya mikrobiyom çalışmaları da yaprak dokuları üzerinde yapılabilir.
