يستخدم هذا البروتوكول نهجاً مبسطاً لقياس التعبير الجيني النباتي استجابة لحشرات الحشرات. باستخدام أوراق منفصلة معزولة في أطباق بيتري ، فإن الحشرات أسهل في تطبيقها ومراقبتها خلال فترة قصيرة نسبيًا من الإصابة تساهم في بيانات التعبير الجيني القابلة للتكاثر. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع العديد من التفاعلات بين النباتات والحشرات.
إذا تم النظر في الملاحظات الأساسية من أنظمة المصنع بأكملها. يمكن أن تكون الطبيعة غير المتوقعة لتغذية الحشرات أمرًا صعبًا. لذلك ، توفر إمدادات يمكن الاعتماد عليها من اليرقات والنباتات الصحية بشكل صحيح أفضل فرصة للنجاح.
إن تصور كيفية ظهور النباتات والحشرات الصحية وسلوكها أمر مفيد لتحقيق أفضل النتائج خاصة للباحثين الجدد في مجال الدراسة. إظهار الإجراء معي سيكون فرانسيس بيريز، عالم الأحياء الجزيئية في تحسين الوراثية من الفواكه والخضروات مختبر. لإعداد النباتات المزروعة زراعة الأنسجة المزروعة زراعة، أولا الحصول على النباتات كينيبيك نمت من المواد explant مع ما لا يقل عن ثلاث إلى أربع عقد.
استخدام شفرة معقمة لإزالة الأوراق قطع الفروع قريبة من الجذعية الرئيسية وترك حوالي مليمترين من الأنسجة الفرع في كل ورقة. قطع ما يقرب من مليمترين فوق وتحت كل عقدة لإزالة المقاطع العقدية من السيقان وترتيب القطع العقدية في وعاء ثقافة الأنسجة العقيمة التي تحتوي على وسيطة نقل العقدية مع الفرع مشيرا إلى أعلى. ثم نقل قصاصات العقدة إلى غرفة زراعة الأنسجة النباتية لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من النمو عند 24 درجة مئوية وفترة تصوير داكنة لمدة 16 ساعة.
لإعداد الحشرات للتغذية ، الحصول على مرحلة اليرقات المرغوبة من M.sexta ونقل يرقة واحدة إلى كل بئر من وعاء الاحتواء المناسب وفقًا لحجم اليرقة. جعل قوالب التنسيب لكل نقطة وقت الحصاد باستخدام خمسة الصواني قوي قادرة على عقد مجموعة من ستة أطباق بيتري الحجم المناسب اصطف مع ورقة بيضاء. تتبع مجموعة من الدوائر الست باستخدام طبق بيتري الحجم المناسب على الورق في كل صينية وتسمية مجموعة واحدة من الدوائر التحكم A و B و C و الأخرى الموبوءة A و B و C.Then تسمية كل قالب موضع مع وقت الحصاد المناسب.
المقبل، تسمية واحد 1.7 ملليلتر microcentrifuge أنبوب لكل دائرة في قالب موضع لتحديد مناسب الانزعاج، محطة رسالة النسخ المتماثل ونقطة الحصاد الوقت. عندما تم تسمية جميع الأنابيب ، ضع قرص ورق فلتر معقمة في طبق بيتري واحد لكل قالب وبلل الأقراص بالماء العقيم دون السماح للبركة السائلة الزائدة في كل طبق. ثم ضع طبق واحد في كل دائرة في كل قالب موضع ووضع ثلاثة نباتات بطاطا من نفس العمر والحجم النسبي بجانب كل قالب موضع.
لبدء الإصابة، واستخدام مقص معقمة لإزالة أعلى حجم اثنين أوراق مطابقة من كل نبات ووضع ورقة واحدة في طبق بيتري التحكم واحدة في طبق بيتري الموبوءة لكل نبات في أسرع وقت ممكن. عندما تم وضع جميع الأوراق ، استخدم ملقطًا ناعمة تعمل باللمس لنقل يرقة واحدة على الأقل إلى كل طبق موبوء في أسرع وقت ممكن وتعيين المؤقت لوقت الإصابة المطلوب. مراقبة التغذية للتأكد من أن جميع اليرقات تأكل، لتحل محل أي يرقات غير تغذية حسب الضرورة.
إزالة كل من اليرقات من جميع الأوراق في نهاية وقت الإصابة وبدء الموقت للحصاد. في نهاية كل نقطة وقت الحصاد، نقل كل ورقة في أنبوب المقابلة وإسقاط الأنبوب فورا في النيتروجين السائل لتجميد عينة ورقة قبل التخزين في ناقص 80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي. الصحّيّة بدقة يرقات ينبغي أن يبدأ تغذية مباشرة بعد وضع على الورقة سطح ولتغذية سوفت استمرّت في طريقة متوافقة إلى حدّ ما طوال الغزو فترة زمنيّة.
لم تستهلك اليرقة في الجزء السفلي من هذه الورقة أي مواد نباتية وهي مثال على الإصابة غير الناجحة. تم فصل هذه الأوراق عن نباتات زراعة الأنسجة التي تم نشرها منذ أسبوعين واستهلكت بمعدلات مختلفة وأنماط التغذية لكل مرحلة من مراحل اليرقات. وبناء على هذه النتائج، تم اختيار يرقات رابعة من النجوم لمواصلة تقييم الأضرار التي لحقت بالأوراق بالنسبة لنباتات البطاطا المزروعة في التربة الأكثر نضجاً التي تقارب نباتات البطاطا المزروعة في الحقل بشكل أوثق.
في هذه الدراسات التعبير الجيني، تم تحديد اثنين جديد من عوامل نسخ إصبع الزنك C2H2 التي تستجيب بقوة للعاج M.sexta دعم استخدام أوراق منفصلة لمعاينات الإصابة. تذكر استخدام أوراق الشجر المتطابقة مع العمر والحجم وأن تُدَهّد اليرقات بشكل صحيح لكل تجربة حيث تؤدي التوحيد إلى مزيد من البيانات القابلة للتكرار. يمكن تحليل أنسجة الأوراق لأنواع الأكسجين التفاعلية المستحثة بالإجهاد ومشتقات هرمون حمض الجاسمونيك.
يمكن أيضًا إجراء دراسات كاملة أو بروتيوم أو ميكروبيوم على أنسجة الأوراق.
