Dieses Protokoll verwendet einen schlanken Ansatz zur Messung der Pflanzengenexpression als Reaktion auf Insektenkraut. Durch die Verwendung von freistehenden Blättern, die in Petrischalen isoliert sind, sind die Insekten während der relativ kurzen Befallzeit leichter anzuwenden und zu überwachen und tragen zu reproduzierbaren Genexpressionsdaten bei. Dieses Protokoll kann an viele Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Insekt angepasst werden.
wenn Basisbeobachtungen aus ganzen Anlagensystemen berücksichtigt werden. Die Unberechenbarkeit der Insektenfütterung kann eine Herausforderung sein. Daher bietet eine zuverlässige Versorgung mit gut inszenierten Larven und gesunden Pflanzen die besten Erfolgsaussichten.
Die Visualisierung, wie gesunde Pflanzen und Insekten auftreten und sich verhalten sollten, ist entscheidend für optimale Ergebnisse, insbesondere für Forscher, die neu auf dem Gebiet der Studie sind. Mit mir wird das Verfahren demonstriert: Frances Perez, Molekularbiologin für die genetische Verbesserung von Obst und Gemüse laboriert. Um Knoten vermehrte GewebeKultur Kartoffelpflanzen vorzubereiten, erhalten Sie zuerst Kennebec Pflanzen aus Explant-Material mit mindestens drei bis vier Knoten.
Verwenden Sie eine sterile Klinge, um die Blätter zu entfernen, die die Zweige in der Nähe des Hauptstamms schneiden und etwa zwei Millimeter Astgewebe pro Blatt hinterlassen. Schneiden Sie etwa zwei Millimeter über und unter jedem Knoten, um die Knotenabschnitte von den Stielen zu entfernen und die Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß mit Knotentransfermedium mit nach oben zeigendem Ast anzuordnen. Dann übertragen Sie die Knotenschnitte für zwei bis drei Wochen Wachstum bei 24 Grad Celsius und eine 16-stündige helle, achtstündige dunkle Fotoperiode in eine Pflanzengewebekulturkammer.
Um die Insekten für die Fütterung vorzubereiten, erhalten Sie das gewünschte Larvenstadium von M.sexta und übertragen Sie eine Larve in jeden Brunnen eines geeigneten Einschließungsgefäßes entsprechend der Größe der Larve. Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt mit fünf stabilen Schalen, die einen Satz von sechs mit weißem Papier ausgekleideten Petrischalen in angemessener Größe halten können. Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach und beschriften Sie einen Satz von Kreisen, die A, B und C steuern, und die anderen befallenen A, B und C.Dann beschriften Sie jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.
Als Nächstes beschriften Sie ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jeden Kreis in der Platzierungsvorlage, um die Störung, den Pflanzenreplikationsbuchstaben und den Erntezeitpunkt entsprechend zu identifizieren. Wenn alle Rohre beschriftet sind, legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in eine Petrischale pro Schablone und befeuchten Sie die Scheiben mit sterilem Wasser, ohne überschüssigeFlüssigkeit in jeder Schale zu lassen. Legen Sie dann in jeder Platzierungsvorlage ein Gericht in jeden Kreis und platzieren Sie drei Kartoffelpflanzen gleichen Alters und relativer Größe neben jeder Platzierungsvorlage.
Um den Befall zu initiieren, verwenden Sie sterile Schere, um die oberen zwei Größe abgestimmten Blätter von jeder Pflanze zu entfernen und legen Sie ein Blatt in der Kontrolle Petrischale und eine in der befallenen Petrischale für jede Pflanze so schnell wie möglich. Wenn alle Blätter platziert sind, verwenden Sie Soft-Touch-Zangen, um mindestens eine Larve so schnell wie möglich in jede befallene Schale zu übertragen und den Timer für die gewünschte Befallzeit einzustellen. Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen, und ersetzen Sie bei Bedarf alle nicht fütternden Larven.
Entfernen Sie alle Larven von allen Blättern am Ende der Befallzeit und starten Sie den Timer für die Ernte. Am Ende jedes Erntezeitpunkts jedes Blatt in die entsprechende Röhre geben und die Röhre sofort in flüssigen Stickstoff geben, um die Blattprobe vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Isolierung einzufrieren. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten unmittelbar nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während des Befallszeitraums ziemlich konsistent fortgesetzt werden.
Die Larve am Boden dieses Blattes verbrauchte kein Pflanzenmaterial und ist ein Beispiel für einen erfolglosen Befall. Diese Blätter wurden von zwei Wochen alten, sich vermehrten Gewebekulturpflanzen gelöst und mit unterschiedlichen Raten und Fütterungsstilen für jedes Larvenstadium verzehrt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden vierte Instar-Larven ausgewählt, um die Schäden an den Blättern für reifere Kartoffelpflanzen, die sich den Feldkartoffeln annähern, weiter zu bewerten.
In diesen Genexpressionsstudien wurden zwei neue C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die robust auf M.sexta-Kräutersindien reagieren und die Verwendung von freistehenden Blättern für Befall-Assays unterstützen. Denken Sie daran, Alter und Größe abgestimmte Blätter zu verwenden und die Larven für jedes Experiment richtig zu inszenieren, da die Homogenität zu reproduzierbareren Daten führt. Blattgewebe kann auf stressinduzierte reaktive Sauerstoffspezies und Jasmonsäurehormonderivate geprüft werden.
Ganze Transkriptom, Proteom, oder Mikrobiom Studien können auch auf dem BlattGewebe durchgeführt werden.
