高压冷冻、微波辅助对比度增强和最小树脂嵌入在体积成像中的生物样品制备

该样品制备技术旨在将超结构保存的最佳质量与聚焦离子束扫描电子显微镜中最适合成像模式的对比度相结合。该协议对于需要高压冷冻制备以进行可靠的超结构保存但在体积成像冻结替换期间没有足够的对比度的样品特别有用。对于最小的树脂嵌入，必须去除尽可能多的树脂，以便稍后在聚焦离子束扫描电子显微镜中正确定位。

首先，使用移液器在切割垫上滴一滴 20%PVP PBS。将解剖的神经头骨浸入液滴中。使用手术刀切割样品的两毫米长度。

使用精细钳子将样品放在 0.2 毫米深的 A 型金属样品托架中。将托架转移到墨盒的中间板中。将六氯苯涂层的 B 型托架作为盖子放在顶部。

通过降低墨盒的上半部分关闭组件。关闭高压冰柜装载站的三件式墨盒。按下工艺按钮，然后按照制造商的操作说明继续操作。

在液氮浴中，将样品载体放入含有两毫升冷冻0.1%坦尼酸和丙酮的冷冻小瓶中，并关闭瓶盖。将冷冻小瓶放入零下 90 摄氏度的冷冻替换单元中。启动程序，将样品保留 100 小时。

在冷冻替代装置中，用两毫升丙酮清洗样品三次，30分钟。将2%的三氧化二氮放入0.1%的醋酸尿酸尿样中，冷却，并加入样品中，在零下90摄氏度下持续染色7小时。当冷冻替代单元中的程序温度达到零下20摄氏度时，将样品再保留16小时。

当温度上升到4摄氏度时，丢弃小瓶中的液体并填充纯丙酮。从冷冻替换装置中取出冷冻瓶。冷冻前和渗透前的样品处理至关重要，因为样品可能会受到严重损坏。

在烟罩中，使用细钳将金属载体从冷冻瓶中取出，然后从容器中转移样品，将其淹没在充满丙酮的 150 毫米深的手表玻璃盘中。使用精细钳子将样品转移到两个充满丙酮的毫升反应管中。将微波炉设置为 250 瓦 40 秒，然后启动微波炉清洗样品并重复四次。

将1%硫化氢化物溶液的一毫升移液放入反应管中，放入微波炉中。打开真空功能，打开两分钟，关闭两分钟，总共 14 分钟，将其设置为 150 瓦。启动微波炉。

与之前一样，用丙酮清洗样品四次。将一毫升2%的三氧化二氮溶液放入反应管。将样品放在微波炉中，并使用与硫化物相同的微波设置。

与之前一样，用丙酮清洗样品四次。将一毫升25%树脂在丙酮中放入反应管中放入反应管中，放入微波炉中。打开真空功能三分钟，将其设置为 250 瓦。

启动微波炉。使用牙签将神经性铁皮从反应管中去除，并放在一块塑料薄膜上。将卤素灯放在样品附近，以加热树脂。

使用牙签，轻轻将样品推至塑料薄膜上，直到未检测到剩余的树脂。将样品放在烤箱顶部的塑料薄膜，将温度设置为 60 摄氏度，使样品聚合至少 48 小时。使用剃须刀刀片切割聚合样品与塑料薄膜一起，大小适合 SEM 存根。

使用牙签在 SEM 根根上添加导电银树脂，并将切割样品附加到其上。然后在样品周围添加树脂。将SEM根根放入烤箱，在60摄氏度下聚合至少4小时或过夜。

聚合后，将 SEM 存根放在溅射涂布器中。将溅射涂层设置为 35 毫安，并涂抹 10 纳米厚的金涂层或涂层一分钟。涂覆后，将SEM存根放在聚焦离子束扫描电子显微镜内。

在这项研究中，对小鼠和C.elegans的神经性头骨进行了增强性协议，以说明使用聚焦离子束扫描电子显微镜进行3D体积成像的最佳保存和对比度。标准协议通常缺乏膜对比度，而增强型协议可提供强大的膜对比度。具有增强协议和标准协议的 C.elegans 的横截面图像显示了显著的区别。

除了神经钛的横截面图像外，增强的协议还有助于显示与标准协议相比更强的膜对比度。经过后期处理，电子显微镜数据使用图像处理和建模程序（IMOD）进行可视化。蓝色突出显示区域显示分段轴突。

红色突出显示的区域显示 Remak 捆绑包。黄色和橙色突出显示的区域显示梅林护套。绿松石高亮区域显示线粒体。

虚拟再切片和三维模型说明了精细组织架构，并有助于理解其功能。其他体积扫描电子显微镜方法也可用于串行块面扫描电子显微镜和阵列断层扫描。该协议还可用于传输电子显微镜和其他样品类型，如来自中枢神经系统的样品。

三氧化二氮、硫磷酸酯和醋酸兰基是有毒化学品，应谨慎使用。树脂也是有害的，应小心使用。个人防护装备，如手套和实验室外套，应穿完整协议。