使用夹层冷冻装置快速冷冻，在电子显微镜下对生物标本进行良好的超微结构保存

为了观察细胞的精致天然超高结构，有必要通过快速冷冻来固定细胞。三明治冷冻是冷冻细胞而不形成冰晶的最佳方法之一。该协议演示了三明治冷冻装置的使用，并且还描述了在三明治冷冻后制作超薄冷冻替代标本的程序。

通过用液氮填充夹层冷冻装置或SFD的液氮容器来开始制备液态丙烷。通过使用细喷嘴引入丙烷气体，用液态丙烷填充液态丙烷容器。通过使用冷却的金属棒加速丙烷的凝固。

要制备扁平型和篮式铜盘，请将其放在无字母面朝上的载玻片上，并在10帕斯卡，400伏，1毫安的辉光放电下处理30秒，以使用离子点测器装置使圆盘表面亲水。将细胞悬浮液转移到两毫升离心管中，并在室温下以2， 900倍G离心10秒。除去上清液并悬浮沉淀以获得厚悬浮液。

将少量或约0.02微升的细胞悬浮液放在铜盘上。用另一个铜盘盖住它，然后用镊子将圆盘捡起来。用薄金属棒在固体丙烷的中心做一个井。

将镊子设置在SFD中，并通过按下设备的注射按钮快速冻结它们。将用过的镊子浸泡在室温水中以加热它们以冷冻以下标本。使用动物和人体组织固定在2.5%戊二醛，0.1摩尔磷酸盐缓冲液中，pH值为7.4。

在体视显微镜下用剃须刀片将它们切成0.1至0.2毫米厚的部分。将一小滴戊二醛溶液放在篮子式铜盘上，然后用镊子将一块组织放入铜盘上的戊二醛中，并用扁平的铜盘覆盖。如前所述，用SFD熔化的丙烷中的组织快速冷冻圆盘。

将圆盘转移到工作浴中的液氮中。使用一对在液氮中冷却的镊子，将圆盘彼此分开以暴露标本。将带有细胞的圆盘放入装有一毫升含有2%四氧化锇的丙酮的玻璃小瓶中，该丙酮已置于液氮中并固化。

将圆盘转移到深冰箱中，并将其保持在零下80摄氏度下两到四天，以冷冻取代细胞。通过在零下20摄氏度下孵育两小时，在4摄氏度下孵育两小时，在室温下孵育15分钟，逐渐使标本进入室温。将光盘转移到两个装满一毫升丙酮的塑料管中。

通过使用搅拌器将试剂混合在一次性塑料容器中来制备环氧树脂。丙酮在室温下依次用丙酮中的30%树脂，60%树脂和90%树脂分别交换一小时，然后在37摄氏度下将90%树脂与100%树脂交换过夜。最后，将样品嵌入硅包埋模具中的100%树脂中，并在60摄氏度下聚合24小时。

从硅包埋模具中取出聚合块，并在块上写下试样编号。用剃须刀片从块上取下铜盘，并在体视显微镜下使用超声波修剪刀片和剃须刀片修剪嵌入块表面的试样。接下来，在试样块卡盘和切片机的试样支架上贴上胶带，并在边界处切割胶带。

从超切片机中取出块，将其置于体视显微镜中，然后使用剃须刀片将其进一步修剪至0.2毫米×0.3毫米。在网格上涂覆氯丁橡胶，使其具有粘合力。通过对齐胶带部件，将块设置回超切片机上。

用塑料盖覆盖超切片机，切割50至70纳米厚的切片。使用循环检索部分。将它们安装在经过氯丁橡胶处理的300或400目铜网格上并干燥。

在半硅胶管的凹槽中设置带有截面的网格。将标本浸泡在醋酸铀酰溶液中三分钟。收集用过的铀酰溶液并将其储存在注射器中。

用水射流在半管中洗涤标本，然后将标本浸泡在柠檬酸铅中三分钟。对于酵母和真菌标本，将网格放在滤纸上，用镊子捡起它们，并在水面上用等离子聚合萘膜覆盖它们。将网格插入电子显微镜的试样支架中，然后将标本支架插入电子显微镜并在100千伏下观察。

在电子显微镜下观察大肠杆菌和酿酒酵母的超薄切片显示出自然形态和清晰的图像。在电子显微镜下观察使用SFD快速冷冻的培养细胞的超薄切片。人体皮肤超薄切片的图像非常清晰，并显示出自然形态。

用SFD快速冷冻乙型肝炎病毒核心颗粒，并通过冷冻电子显微镜观察。要记住的最重要的事情是，您应该在铜盘上施加非常少量的细胞，以防止冰晶在冻结时形成。通过事先用戊二醛固定动物组织，在约200微米的深度上实现良好的冷冻，类似于高压冷冻所达到的深度。

这项技术为研究人员以低成本轻松观察细胞的精致天然超结构铺平了道路。