Protokolümüz, HIV-1 enfeksiyöz döngüsünü koruyan viral, nükleolar ve nükleolar olmayan konak faktörlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için alternatif yöntemler sunmaktadır. Bu yaklaşımda kullanılan kavramlar, az çalışılan yolların karakterizasyonunu gerektiren diğer viral ve hastalık modelleri için de geçerlidir. Sorun giderme teknikleri diğer protein modellerinde değişiklik için açıklanmıştır.
Prosedürü gösteren Haitang Li ve Pritsana Chomchan, Umut Şehir Beckman Araştırma Enstitüsü Moleküler ve Hücresel Biyoloji Bölümü bilim adamları ve Roger Moore, City of Hope Proteomics Çekirdek ve Moleküler İmmünoloji Bölümü üyeleri olacaktır. HeLa hücre hattı kültürünü üç, 100 milimetrelik kültür plakalarında iki kez-10-altı hücre-mililitre başına yoğunlukta ifade eden bir HLfB büyüterek başlayın. Hücreler uygun konsantrasyona ulaştığında, Rev nükleolar lokalizasyon sinyali içeren 20 mikrogram plazmid 15 mililitrelik bir tüpte 1,76 mililitre TE 79/10 ile ilgi üç ana bayrak mutasyonu, iki molar kalsiyum klorür 240 mikrolitre ilave, ayrıntılı karıştırma ile takip.
Daha sonra, tüp ün içeriğini iki mililitre 2x HBS içeren 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve ardından bir girdap makinesinde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, yağış girdap. Hafifçe orta dönerken üç, 100 milimetrelik HLfB kültür plakaları her damla akıllıca süspansiyon bir mililitre ekleyin.
Hücre kültürü kuluçka altı saatlik kuluçka sonra, taze kültür ortamı 10 mililitre transfection karışımı değiştirin ve başka bir 42 saat için kuvöz hücreleri iade. Transfeksiyondan 48 saat sonra, her tabağı biyolojik tehlike seviyesi iki doku kültürü başlığı içinde bir buz yatağına yerleştirin. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre katmanlarını bozmadan 10 mililitre önceden soğutulmuş PBS ile hücreleri hafifçe durulayın.
Hücreleri duruladıktan sonra PBS'yi atın. Daha sonra, bir mililitre likis tampon ile hücreleri tedavi, proteaz inhibitörü kokteyl ile takviye, plaka başına. Hücreleri bir havuza toplamak için plakaları yatırarak, katmanları el ile bozmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
1,000 mikrolitrelik mikropipet kullanarak, her tabaktan lysate'yi buz üzerinde 15 dakikalık bir kuluçka için 15 mililitrelik bir tüpe havuzlayın ve her beş dakikada bir girdap layın. Kuluçka sonunda, üç, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler içine lysates aliquot ve santrifüj ile lysates toplamak. Supernatant'ı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve el yazmasında açıklandığı gibi viral protein lisat konsantrasyonu elde edin.
Rev nükleolar lokalizasyon sinyali üç ana bayrak coimmunoreen için, taze lysis tampon 500 mikrolitre ile üç kez M2 afinite jel boncuk 25 mikrolitre durulayın, proteaz inhibitörü kokteyl ile takviye, yıkama başına. Bu adımları soğuk bir odada veya buz üzerinde reaktifler ile gerçekleştirin. Son durulama dan sonra, beş mililitre likis tamponunun son hacminde durulanmış boncuklara mililitre başına bir mililitrelik viral protein konsantrasyonu ekleyin.
Reaksiyonu üç saat boyunca dört santigrat derecede döndürün. Kuluçka sonunda, santrifüj ile viral protein lisate-konjuge boncukpelet. Post-immünopresipitasyon lysate protein konsantrasyonunun ölçümü için supernatant toplayın.
Örnek depolama talimatları için el yazmasına bakın. Viral protein lisate konjuge boncuk pelet için lysis tampon 750 mikrolitre ekleyin, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine boncuk transfer ve dört derece santigrat beş dakika boyunca bir rotator boncuk yıkayın. Sadece gösterildiği gibi, rotator üzerinde ek bir iki yıkama için santrifüj tarafından boncuk toplamak.
Son yıkamadan sonra, boncuk-coimmununoçöken kompleksten lysis tampon herhangi bir iz kaldırmak için bir kıstırılmış, uzun, jel yükleme ucu kullanın. 2x yükleme tampon55 mikrolitre boncukre askıya alın. Daha sonra numuneyi 95 derecede 10 dakika kaynatın.
Bir batı leke jeli üzerine eluate 25 mikrolitre yük ve bir Coomassie SDS-PAGE jel boyama. SDS-PAGE jel elektroforezinin tamamlanmasından sonra jeli 25 mililitre ultra saf suda üç kez 15 dakika durulayın. Son yıkamadan sonra, jel üzerine Coomassie leke reaktif 100 mililitre ekleyin.
Tam boyama protokolü için el yazmasına bakın. Jel bantlarının sindirimi için, önce jelin tüm şeridinden jel bantlarını kesmek için temiz bir jilet kullanın, her mutasyonu temsil eden, yaklaşık beş milimetrelik küpler halinde. Her bandı temiz, 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe yerleştirin.
Bantları, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 100 milimolar amonyum bikarbonatla iki kez kaplayın. Sonra, bir vakum santrifüj içinde beş dakika jel parçaları kuru. Proteinleri azaltmak için, 100 milimolar amonyum bikarbonat 100-milimolar amonyum bikarbonat 100-milimolar amonyum bikarbonat kurutulmuş jel parçaları ile kaplayın 56 santigrat derece bir saatlik kuluçka için, karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca suda alkililasyon takip 100-milimoler iyodoacetamide.
Daha sonra, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayarak, 100 milimolar amonyum bikarbonat takip asetonitril ile jel parçaları iki kez küçültmek ve reswell. İkinci şişlikten sonra jel parçalarını vakumsantrifüjünde beş dakika kurulayın. 100-milimolar amonyum bikarbonat sıralama dereceli modifiye tripsin mikrolitre başına 50 nanogram ile jel parçaları şişpler.
Beş dakika sonra, 100-milimolar amonyum bikarbonat ile jel parçaları kapağı, ve onları tamamen reswell izin, şişmiş jel parçaları tamamen kaplı böylece ek 100-milimolar amonyum bikarbonat ekleyerek. Daha sonra, jel parçalarını bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, numunelerin hacminin 1/10'u ile reaksiyonu ertesi sabah suda %10 formik asitle durdurun ve her tüpten süpernatant toplayın. Rev nükleolar lokalizasyon sinyali üç asal bayrak sodyum klorür çeşitli konsantrasyonlarda içeren üç farklı lisis tampon koşulları altında tespit edilebilir.
B23 ayrıca düşük tuz konsantrasyonu içeren lysis tamponunda tespit edilebilir, orta tuz konsantrasyonu içeren lysis tamponunda zar zor tespit edilebilir ve yüksek tuz konsantrasyonu içeren lysis tamponunda tespit edilemez. B23 tespiti, yabani tip Rev üç asal bayraklı düşük sodyum klorür konsantrasyonu içeren lysis tamponunda en uygun şekildedir ve Rev nükleozlar lokalizasyon sinyali M1 üç asal bayrak ile yakınlığı kaybeder. Yabani tip Rev üç asal bayrak ile B23 yakınlık da daha yüksek bir tuz konsantrasyonu ile azalır, ve pcDNA negatif kontrol her iki lysis tampon koşulları altında immünopredikasyon sonra nonspesifik immünositasyon verim vermez.
Rev nükleolar lokalizasyon sinyali üç asal bayrak en 2x örnek yükleme tampon kaynama yoluyla elution sonra tespit edilebilir, B23 37 ve 95 derecelik santigrat örnek tampon kuluçka koşulları altında tespit edilir. İmmünenyağış ve gümüş boyama sonra, gösterildiği gibi, yabani tip Rev ve Rev nükleolar lokalizasyon sinyalleri M2, M6, ve M9 18 kilodaltons tespit edilebilir. B23 proteinine karşılık gelen bantlar da 37 kilodalton belirteçte gözlenir.
Coomassie reaktifi ile boyama daha rev nükleolar lokalizasyon sinyali varlığı ve 18 kilodalton mutasyonların yokluğunda üç asal bayrak tespit edilebilirliğini göstermektedir. Olası bağlama faktörleri için sorun giderme ve tarama işlemi sırasında hastalık modelinize ilişkin başvurular için gerekli olan pozitif ve negatif birçok denetim kullanın. Tüm silme ve tek noktalı mutasyonlar vahşi tip Rev ile multimerizasyon yoluyla baskın-negatif aktivite için incelenebilir ve HIV-1 replikasyonunun tutuklanmasında kullanılabilir.
