Notre protocole fournit d’autres méthodes pour l’identification et la caractérisation des facteurs d’hôte viraux, nucléolaires et non nucléolaires qui maintiennent le cycle infectieux du VIH-1. Les concepts utilisés dans cette approche s’appliquent à d’autres modèles viraux et de maladies nécessitant la caractérisation des voies sous-étudiées. Des techniques de dépannage sont décrites pour modification à d’autres modèles protéiques.
Haitang Li et Pritsana Chomchan, scientifiques du département de biologie moléculaire et cellulaire de l’Institut de recherche Beckman de la Cité de l’espoir, et Roger Moore, membres du centre protéomique de la cité de l’espoir et du département d’immunologie moléculaire, démontreront la procédure. Commencez par cultiver une culture de lignée cellulaire HLfB exprimant habilement hela dans trois plaques de culture de 100 millimètres à une densité deux fois-10-à-la-six-cellules-par-millilitre. Lorsque les cellules atteignent la concentration appropriée, mélanger 20 microgrammes de plasmide contenant le signal de localisation nucléolaire Rev mutation de drapeau à trois premiers d’intérêt avec 1,76 millilitres de TE 79/10 dans un tube de 15 millilitres, suivie de l’ajout de 240 microlitres de chlorure de calcium à deux molaires, avec mélange complet.
Ensuite, transférez le contenu du tube dans le sens de largage dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de 2x HBS, suivi d’un mélange sur une machine vortex. Après 30 minutes à température ambiante, vortex les précipitations. Ajouter un millilitre de la suspension dans le sens de la chute à chacune des trois plaques de culture HLfB de 100 millimètres tout en tourbillonnant doucement le milieu.
Après une incubation de six heures dans l’incubateur de culture cellulaire, remplacez le mélange de transfection par 10 millilitres de milieu de culture frais et retournez les cellules à l’incubateur pendant encore 42 heures. 48 heures après la transfection, placer chaque assiette sur un lit de glace dans une hotte de culture de tissu de niveau deux au risque biologique. Retirez le média de culture cellulaire et rincez doucement les cellules avec 10 millilitres de PBS préchilled, sans perturber les couches cellulaires.
Jetez le PBS après le rinçage des cellules. Ensuite, traitez les cellules avec un millilitre de tampon de lyse, complété par un cocktail inhibiteur de la protéase, par assiette. En inclinant les plaques pour rassembler les cellules dans une piscine, utilisez un grattoir cellulaire pour perturber manuellement les couches.
À l’aide d’une micropipette de 1000 microlitres, mettre le lysate de chaque assiette en tube préchilleux de 15 millilitres pour une incubation de 15 minutes sur la glace, avec vortex toutes les cinq minutes. À la fin de l’incubation, aliquot les lysates en trois tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, et de recueillir les lysates par centrifugation. Transférez le supernatant dans un nouveau tube de 15 millilitres et obtenez la concentration de lysate de protéine virale, telle que décrite dans le manuscrit.
Pour la coimmunoprecipitation du signal de localisation nucléolar Rev drapeau à trois premiers, rincer 25 microlitres de perles de gel d’affinité M2 trois fois avec 500 microlitres de tampon de lyse fraîche, complétée par un cocktail inhibiteur de la protéase, par lavage. Effectuez ces étapes dans une pièce froide ou avec les reagents sur la glace. Après le dernier rinçage, ajouter une concentration d’un milligramme par millilitre de lysate de protéines virales aux perles rincées dans un volume final de cinq millilitres de tampon de lyse.
Incuber la réaction pendant trois heures à quatre degrés Celsius avec rotation. À la fin de l’incubation, pelleter les perles conjuguées à la protéine virale par centrifugation. Recueillir le supernatant pour mesurer la concentration de protéines lysate post-immunoprécipitation.
Consultez le manuscrit pour obtenir des instructions de stockage d’échantillons. Ajouter 750 microlitres de tampon de lyse à la pastille de perle conjuguée à la protéine virale, transférer les perles dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et laver les perles sur un rotateur pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir les perles par centrifugation pour deux lavages supplémentaires sur le rotateur, comme vient de le démontrer.
Après le dernier lavage, utilisez une pointe pincée, longue et gel-chargement pour enlever toutes les traces de tampon de lyse du complexe de perle-coimmununoprecipitation. Resuspendez les perles dans 55 microlitres de tampon de chargement 2x. Ensuite, faire bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Chargez 25 microlitres d’évalation sur un gel de tache occidental et un gel Coomassie tacher SDS-PAGE. Après l’achèvement de l’électrophorèse gel SDS-PAGE, rincer le gel trois fois en 25 millilitres d’eau ultrapure pendant 15 minutes. Après le dernier lavage, ajouter 100 millilitres de reagent de tache Coomassie sur le gel.
Voir le manuscrit pour le protocole de coloration complet. Pour la digestion des bandes de gel, utilisez d’abord une lame de rasoir propre pour couper les bandes de gel de toute la voie du gel, représentant chaque mutation, en cubes d’environ cinq millimètres. Placez chaque bande dans un tube de microcentrifugeuse propre de 0,5 millilitre.
Couvrir les bandes deux fois avec du bicarbonate d’ammonium de 100 millimlaires dans une solution d’acétyonitrile à l’eau en une seule fois à température ambiante pendant 15 minutes par lavage. Ensuite, séchez les morceaux de gel pendant cinq minutes dans une centrifugeuse sous vide. Pour réduire les protéines, couvrir les morceaux de gel séché d’un dithiothreitol de 10 millimollaires en bicarbonate d’ammonium de 100 millimollars pendant une incubation d’une heure à 56 degrés Celsius, suivi de l’alkylation dans l’iodoacetamide 100 millimolaire dans l’eau pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité.
Ensuite, rétrécissez et reswell les morceaux de gel deux fois avec de l’acétyonitrile, suivie d’un bicarbonate d’ammonium de 100 millimaux, les deux avec secousses douces à température ambiante pendant 15 minutes. Après le second reswelling, sécher les morceaux de gel pendant cinq minutes dans une centrifugeuse sous vide. Gonflez les morceaux de gel avec 50 nanogrammes par microlitre de trypsine modifiée de qualité séquençage en bicarbonate d’ammonium de 100 millimlaires.
Après cinq minutes, couvrir les morceaux de gel avec du bicarbonate d’ammonium de 100 millimlaires, et leur permettre de se résorber complètement, en ajoutant un bicarbonate de munitions supplémentaire de 100 millimlaires afin que les morceaux de gel gonflés soient complètement recouverts. Puis, incuber les morceaux de gel pendant la nuit à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec 1/10 du volume des échantillons avec 10% d’acide formique dans l’eau le lendemain matin, et de recueillir le surnatant de chaque tube. Rev nucléolar signal de localisation à trois premiers est détectable dans trois conditions tampons de lyse différentes contenant diverses concentrations de chlorure de sodium.
B23 est également détectable dans le tampon de lyse contenant la concentration inférieure de sel, à peine détectable dans le tampon de lyse contenant la concentration moyenne de sel, et indétectable dans le tampon de lyse contenant une concentration élevée de sel. La détection B23 est optimale dans le tampon de lyse contenant la faible concentration de chlorure de sodium avec le drapeau à trois premiers rev de type sauvage et perd son affinité avec le signal de localisation nucléolaire Rev M1 drapeau à trois premiers. L’affinité B23 avec le drapeau à trois premiers rev de type sauvage diminue également avec une concentration plus élevée de sel, et le contrôle négatif de pcDNA ne donne pas l’immunodédetection non spécifique après immunoprécipitation dans les deux conditions tampons de lyse.
Rev signal de localisation nucléolaire drapeau à trois premiers est le plus détectable après l’élitution par ébullition dans 2x tampon de chargement de l’échantillon, tandis que B23 est détectable à la fois dans les conditions d’incubation tampon échantillon de 37 et 95 degrés Celsius. Après l’immunoprécipitation et la coloration d’argent, comme démontré, les signaux nucléolar de type sauvage Rev et Rev M2, M6 et M9 sont détectables à 18 kilodaltons. Des bandes correspondant à la protéine B23 sont également observées au marqueur de 37 kilodaltons.
La coloration avec le reagent de Coomassie démontre davantage la détectable du signal de localisation nucléolar rev drapeau à trois premiers en présence et l’absence de mutations à 18 kilodaltons. Utilisez autant de contrôles, positifs et négatifs, que nécessaire pour les références qui se rapportent à votre modèle de maladie pendant le processus de dépannage et de dépistage des facteurs de liaison potentiels. Toutes les suppressions et les mutations à un point peuvent être examinées pour l’activité dominante négative par multimérisation avec rev de type sauvage et utilisées dans l’arrêt de la réplication du VIH-1.
