우리의 프로토콜은 HIV-1 전염성 주기를 유지하는 바이러스성, 뉴클레오및 비뉴클레오라 숙주 인자의 식별 및 특성화를 위한 대체 방법을 제공합니다. 이 접근법에 사용된 개념은 연구되지 않은 통로의 특성화를 요구하는 그밖 바이러스성 및 질병 모형에 적용됩니다. 문제 해결 기술은 다른 단백질 모델의 변형을 위해 설명됩니다.
절차를 시연하는 것은 하이탕 리와 프리차나 Chomchan, 희망의 도시에 있는 베크만 연구소에 분자 및 세포 생물학 부의 과학자, 그리고 로저 무어, 희망 의 도시 Proteomics 코어및 분자 면역학의 부의 일원일 것입니다. HLfB를 3개, 100mm 배양 판에서 밀리리터당 2배-10-6세포-세포-밀도로 안정적으로 발현하는 HLfB를 성장시킴으로써 시작하십시오. 세포가 적절한 농도에 도달하면, 15 밀리리터 튜브에 TE 79/10의 1.76 밀리리터와 관심의 3-주요 플래그 돌연변이를 포함하는 플라스미드의 20 마이크로그램을 혼합하고, 철저한 혼합과 함께 2개의 어금니 칼슘 염화칼슘240 마이크로리터를 첨가한다.
다음으로, 튜브의 내용을 2x HBS의 2밀리리터를 포함하는 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고, 이어서 소용돌이 기계에 혼합한다. 실온에서 30 분 후, 강수량을 소용돌이. 배지를 부드럽게 소용돌이치면서 3개의 100mm HLfB 배양 플레이트에 서스펜션 1밀리리터를 드롭방향으로 넣습니다.
세포 배양 배양인 배양기에서 6시간 배양 후, 트랜스퍼레이션 혼합물을 신선한 배양 배지의 10밀리리터로 대체하고 세포를 인큐베이터로 42시간 동안 되돌려 보도록 한다. 트랜스펙트 후 48시간, 각 플레이트를 생물학적 위험 수준 2조직 배양 후드 내에 얼음 침대에 놓습니다. 세포 배양 매체를 제거하고 세포 층을 방해하지 않고 10 밀리리터의 미리 냉각된 PBS로 세포를 부드럽게 헹구십시오.
세포를 헹구고 PBS를 폐기합니다. 다음으로, 용해 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 치료, 프로테아제 억제제 칵테일으로 보충, 접시 당. 플레이트를 기울여 셀을 풀로 모으고 셀 스크레이퍼를 사용하여 레이어를 수동으로 방해합니다.
1, 000 마이크로파이프를 사용하여 각 플레이트의 용액을 얼음 에 15분 간 배양하고 5분마다 소용돌이를 가꾸어 줍니다. 인큐베이션의 끝에서, 알리엇은 3개의, 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 lysates를 인용하고, 원심분리에 의하여 용액을 수집합니다. 새로운 15 밀리리터 튜브로 상체를 전송하고, 원고에 설명된 바와 같이 바이러스 성 단백질 용액 농도를 얻는다.
Rev 뉴클레오라 국소화 신호 3-프라임 플래그의 공존 침전을 위해, M2 친화성 젤 비드의 25 마이크로리터를 3회 헹구고 500마이크로리터의 신선한 용해 완충제와 함께 세척당 보충한다. 차가운 방이나 얼음 시약으로 이러한 단계를 수행하십시오. 마지막 헹구기 후에, 용해 완충제의 5 밀리리터의 최종 부피에 헹구는 비드에 바이러스 성 단백질 용액의 밀리그램 당 1 밀리그램 농도를 추가합니다.
회전과 섭씨 4도에서 3 시간 동안 반응을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 바이러스 성 단백질 lysate-conjugated 구슬을 펠릿. 면역 후 침전성 용해 단백질 농도의 측정을 위한 상체를 수집합니다.
샘플 저장 지침은 원고를 참조하십시오. 750 마이크로리터의 용해 완충제를 바이러스 성 단백질 리제액-컨쥬게이드 비드 펠릿에 넣고 구슬을 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브로 옮기고, 섭씨 4도에서 5분간 회전자에 구슬을 세척합니다. 방금 입증된 대로 회전기에 두 개의 세설을 원심분리하여 구슬을 수집합니다.
마지막 세척 후 꼬집고 긴 젤 로딩 팁을 사용하여 비드-코임무누노침전 복합체에서 용해 버퍼의 흔적을 제거하십시오. 2배 적재 버퍼의 55마이크로리터에서 구슬을 다시 분리합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 끓입니다.
1개의 서쪽 블롯 젤에 용루제 25 마이크로리터와 1개의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 젤을 적재합니다. SDS-PAGE 젤 전기포고증이 완성된 후, 15분 동안 초순수 25밀리리터에서 젤을 세 번 헹구세요. 마지막 세척 후, 젤에 쿠마시 얼룩 시약 100 밀리리터를 추가합니다.
전체 염색 프로토콜에 대한 원고를 참조하십시오. 젤 밴드의 소화를 위해 먼저 깨끗한 면도날을 사용하여 젤의 전체 차선에서 젤 밴드를 잘라내어 각 돌연변이를 약 5mm 큐브로 자웁갑시다. 각 밴드를 깨끗한 0.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 놓습니다.
100밀리알라 암모늄 중탄산염으로 1-1대 1의 아세토닐-투-워터 용액으로 15분간 실온에서 15분간 밴드를 두 번 커버합니다. 그런 다음 진공 원심 분리기에서 젤 조각을 5 분간 건조시하십시오. 단백질을 줄이기 위해 말린 젤 조각을 10밀리머 디티오트레이톨100밀리머 암모늄 중탄산염으로 56도에서 1시간 동안 배양한 다음, 어두운 실내 온도에서 1시간 동안 100밀리알라 요오도아세타미드를 물에 담그고 있습니다.
다음으로, 아세토닐릴로 젤 조각을 두 번 수축하고, 100밀리알라 암모늄 중탄산염이 15분 동안 실온에서 부드럽게 흔들리며 수축하고 젤 조각을 잔류합니다. 두 번째 재붓 후, 진공 원심 분리기에서 5 분 동안 젤 조각을 건조. 100 밀리알라 암모늄 중탄산염에 시퀀싱 등급 수정 트립신의 마이크로리터 당 50 나노 그램젤 조각을 팽창.
5분 후, 100밀리알라 암모늄 중탄산염으로 젤 조각을 덮고 완전히 레웰할 수 있도록 하여 100밀리알라 암모늄 중탄산염을 추가하여 부어오른 젤 조각을 완전히 덮습니다. 이어서, 젤 조각을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고, 다음날 아침 물 속에서 10%의 포믹산으로 시료의 부피의 1/10으로 반응을 멈추고, 각 튜브에서 상퍼를 수집한다. Rev 뉴클레올라 국소화 신호 3-프라임 플래그는 염화 나트륨의 다양한 농도를 포함하는 3개의 상이한 리시스 완충조건 하에서 검출할 수 있다.
B23은 또한 낮은 염 농도를 함유하는 리시스 버퍼에서 검출가능하며, 중염 농도를 함유하는 리시스 버퍼에서 거의 검출할 수 없으며, 높은 염 농도를 함유한 리시스 버퍼에서 검출할 수 없다. B23 검출은 야생형 Rev 3-프라임 플래그를 사용하여 낮은 염화 나트륨 농도를 함유하는 용해 완충제에 최적이며, Rev 뉴클레올라 국소화 신호 M1 3-프라임 플래그와의 친화성을 상실한다. 야생형 Rev 3-프라임 플래그와의 B23 선호도도 염 농도가 높은 것으로 감소하며, pcDNA 음성 제어는 두 리시스 완충조건 하에서 면역침전 후 비특이적 면역검출을 하지 않는다.
Rev 뉴클레올라 국소화 신호 3-프라임 플래그는 2배 샘플 로딩 버퍼에서 끓는 것을 통해 용출 후 가장 검출할 수 있으며 B23은 37도 및 95도 샘플 버퍼 인큐베이션 조건에서 모두 검출할 수 있습니다. 면역 침전 및 은 염색 후, 입증된 바와 같이, 야생형 Rev 및 Rev 뉴클레올라 국소화 신호 M2, M6 및 M9는 18킬로달톤에서 검출된다. B23 단백질에 대응하는 밴드는 또한 37킬로달톤 마커에서 관찰된다.
Coomassie 시약으로 염색하는 것은 18킬로달톤에서 돌연변이의 존재와 부재에서 Rev 뉴클레올라 국소화 신호 3-프라임 플래그의 검출가능성을 더욱 보여줍니다. 잠재적인 결합 요인에 대한 문제 해결 및 스크리닝 과정에서 질병 모델과 관련된 참조에 필요에 따라 양수 및 음수 모두 많은 컨트롤을 사용합니다. 모든 삭제 및 단일 점 돌연변이는 야생 형 Rev를 가진 다중 머화를 통해 지배적 인 부정적인 활성을 검사하고 HIV-1 복제의 체포에 활용 될 수있다.
