Este protocolo es significativo por dos razones principales. Número uno, permite al usuario ser capaz de determinar los estados del ciclo celular de las células de la piel que se han aislado de un modelo animal. También nos permite poder analizar la expresión proteica en las fases discretas del ciclo celular.
En comparación con los métodos anteriores para determinar la proliferación celular, nuestro método permite una determinación más precisa de las diferentes fases en el ciclo celular, y también podemos analizar más de 40 marcadores diferentes en las diversas etapas de la división celular. Esto mejora en gran medida la aplicación y versatilidad del método. Este protocolo se puede utilizar en la investigación del cáncer y en cualquier otro tipo de enfermedad donde hay una necesidad de determinar los patrones específicos de expresión de proteínas del ciclo celular.
Además, este protocolo se puede modificar a otros tipos de células y en otros organismos modelo. El usuario de primera vez debe centrarse en obtener la mejor preparación celular de calidad posible. Esto requiere el procesamiento oportuno de la piel experimental utilizando reactivos frescos, un tiempo mínimo de digestión tisular y una eliminación cuidadosa del sobrenadante después de la centrifugación para preservar la integridad y cantidad de las células.
Para empezar, diseñe un panel de anticuerpos con etiqueta metálica utilizando un software gratuito de diseño de paneles en línea, como se describe en el manuscrito. A continuación, prepare una solución de stock de IdU disolviendo el polvo de IdU a 10 miligramos por mililitro en 0,1 hidróxido de sodio normal a 60 grados centígrados. Después de alícuotar la solución de stock de IdU en tubos de microcentrífuga, congélelos a menos 20 grados Centígrados para su almacenamiento a largo plazo.
Inmediatamente antes de su uso, ajuste el pH de la solución de IdU a 7,5 con 12 ácido clorhídrico normal y pruebe con una tira de pH en una alícuota de descarte para asegurarse de que la solución está a pH 7,5. Para preparar una solución de fijación de dos x paraformaldehído, combine cinco mililitros de 10 x PBS y un mililitro de 16%PFA con 44 mililitros de agua destilada pura de grado molecular. Para preparar 100 solución de cisplatino mililitro, disolver 300,5 miligramos de polvo de cisplatino en 10 mililitros de DMSO.
Para experimentos que se utilizarán durante un día, prepare una solución de trabajo de cisplatino de 10 milimolares. Pesar ratones y luego determinar una dosis en 0,1 miligramos de IdU por gramo de peso corporal. Administrar la dosis calculada de IDU mediante una inyección intraperitoneal y esperar dos horas antes de cosechar las células.
Utilice un par de tijeras de grado quirúrgico para extraer quirúrgicamente la oreja del ratón eutanizado previamente inyectado con IDU en la base de la oreja. Coloque la oreja sobre un plato seco de 100 milímetros de Petri. Separe cuidadosamente la piel anterior de la parte posterior mediante el uso de fórceps finos para crear un bolsillo en el medio o el borde de la zona de corte, luego tire de las dos solapas de la piel, y proceder con las pieles anterior y posterior.
Coloque cuidadosamente las pieles anterior y posterior de un oído en un pozo de una placa de cultivo de 12 pozos, llena de un mililitro de solución de dispase/collagenasa recién preparada, con el lado derma de la piel tocando la solución. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora para digerir la piel. Coloque el oído digerido o la piel neonatal en un plato limpio de Petri con el lado de la epidermis tocando la superficie del plato.
Usando fórceps, aplanar la piel y deslice suavemente la dermis fuera de la epidermis trabajando desde el centro hasta los bordes en un patrón circular. Con fórceps, agarre la epidermis en los bordes y levántela suavemente despegándola de la superficie de la placa Petri. Coloque cuidadosamente la epidermis en la solución de desprendimiento de células precalientadas en un pozo de un plato.
Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados o 20 minutos a temperatura ambiente. Utilice fórceps estériles para agarrar la epidermis y frotar arrastrando la epidermis contra la parte inferior del plato para disociar las células. Añadir un mililitro de DMEM que contenga 1%FBS, y pasar a través de un tamiz celular de 40 micrómetros en un tubo de recolección.
Enjuagar bien con dos mililitros adicionales de DMEM y añadir a la suspensión celular. Después de centrifugar a 120 veces g durante cinco minutos, aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en uno a dos mililitros de DMEM que contiene 1%FBS, y peletizar las células de nuevo como anteriormente.
Para etiquetar las células para determinar las células vivas y muertas, resuspendir de una a tres millones de células en un mililitro de DMEM que contiene 25 cisplatino micromolares e incubar durante un minuto. Apagar por pipeteo con un volumen igual de FBS. Después de centrifugar a 120 veces g durante cinco minutos, decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados que contenga lejía diluida, e invierta los tubos para drenar la solución restante en una toalla de papel.
Resuspender el pellet celular en dos mililitros de PBS libre de catiónio, y centrifugarlos de nuevo como se describió anteriormente. Para fijar las células, resuspender el pellet celular en un mililitro de PBS libre de catión de bario. Vórtice las células bajo baja potencia continua y agregue un mililitro de los dos x búfer de fijación PFA en punto de caída.
Colocar en una plataforma de mecedora e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de centrifugar a 500 veces g durante cinco minutos, decantar cuidadosamente el sobrenadante. Lavar las células con dos mililitros de PBS sin catión de bario, centrífuga de nuevo en las mismas condiciones, y repetir el paso de lavado.
Finalmente, resuspender el pellet en dos mililitros de PBS libre de catión de bario. Centrifugar las células a 500 veces g durante cinco minutos y decantar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de un tampón de fijación x, e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y repetir la centrifugación.
Para lavar las celdas, agregue un mililitro de búfer de permeabilización de código de barras. Durante la centrifugación de la célula a 500 veces g durante cinco minutos, prepare códigos de barras añadiendo 100 microlitros de búfer de permeabilización de código de barras a ellos, y mezcle inmediatamente. Resuspender el pellet celular en 800 microlitros de búfer de permeabilización de código de barras.
Agregue la solución de código de barras a las células, mezcle e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Centrifugar a 500 veces g durante cinco minutos. Lave las células en dos mililitros de tampón de tinción celular y centrífuga de nuevo.
A continuación, resuspender de una a tres millones de células en un mililitro de solución de trabajo de tampón de tinción de antígeno nuclear, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de centrifugar a 500 veces g durante cinco minutos, decantar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de tampón de permeabilización de tinción de antígeno nuclear y centrifugar de nuevo.
Después de repetir la resuspensión y la centrifugación, resuspender el pellet celular en el volumen residual con vórtice suave. Agregue 50 microlitros de cóctel de anticuerpos intracelulares, mezcle e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Agregue dos mililitros de tampón de tinción celular.
Centrifugar de nuevo en las mismas condiciones que en el paso anterior, y retire el sobrenadante. Resuspender el pellet en dos mililitros de tampón de tinción celular, centrífuga a 500 g durante cinco minutos, y repetir el resuspending y centrifugación. Resuspender las células en un mililitro de solución de intercalación, y almacenar durante uno a tres días a cuatro grados Celsius.
Después de centrifugar las células de nuevo, lavar el pellet con dos mililitros de tampón de tinción celular, centrífuga en las mismas condiciones, y realizar dos lavados adicionales con dos mililitros de agua, con la misma centrifugación. Resuspender el pellet celular a una concentración de un millón de células por mililitro con solución de perlas de ecualización diluida, y luego ejecutar las muestras en el citómetro de masa. Se determinan los rendimientos celulares esperados y la viabilidad del oído adulto del ratón y de la piel neonatal.
El rendimiento aproximado depende de la superficie de la piel. La piel neonatal es una mejor opción para experimentos que requieren un mayor número de células. Se muestra la estrategia básica de medición para seleccionar celdas intactas, individuales y viables, después de la normalización y desconvolución de los datos de citometría de masa con códigos de barras.
El porcentaje de células viables puede ser indicativo de la calidad o condición de las células antes de la tinción. También se muestran diferencias en la viabilidad entre las células de carcinoma cultivadas frente a las células aisladas del ratón. Las células viables se cercaron en la longitud del evento frente a CD45 para excluir las células hematopoyéticas.
La inclusión de marcadores de linaje permite la selección de poblaciones celulares de interés en diferentes fases del ciclo celular. El perfil básico del ciclo celular se obtiene mediante la detección de BrdU frente a PI en citometría de flujo basada en fluorescentes. Sin embargo, la inclusión de otros marcadores de proliferación con citometría de masas, permite una identificación más precisa de las fases del ciclo celular.
Siguiendo este enfoque, los perfiles de ciclo celular se pueden construir para diferentes tipos de células o condiciones experimentales, como los perfiles de células positivas CD45 frente a CD45 del mismo experimento. En otro ejemplo, el análisis de marcadores que definen las vías de señalización EGFR y mTOR PI3K en la fase G-one, reveló perfiles de expresión similares en celdas negativas CD45, mostradas en naranja, y células positivas CD45, mostradas en azul. La citometría de masas requiere una gran cantidad de células de alta calidad.
Si un usuario está interesado en una población de células raras, es posible que se necesite un mayor número de celdas. Las células vivas aisladas se pueden utilizar para el análisis de ADN o ARN, estudios bioquímicos, o se pueden utilizar en el cultivo de tejidos antes de la fijación y tinción para la citometría de masas. El usuario debe utilizar equipos de protección personal y un armario de seguridad cuando sea necesario, cuando trabaje con paraformaldehído, ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
