وهذا البروتوكول هام لسببين رئيسيين. رقم واحد، فإنه يسمح للمستخدم لتكون قادرة على تحديد حالات دورة الخلية من خلايا الجلد التي تم عزلها من نموذج حيواني. كما أنه يسمح لنا أن تكون قادرة على تحليل التعبير البروتين في المراحل المنفصلة من دورة الخلية.
بالمقارنة مع الأساليب السابقة لتحديد انتشار الخلايا ، تسمح طريقتنا بتحديد أكثر دقة للمراحل المختلفة في دورة الخلية ، ويمكننا أيضًا تحليل أكثر من 40 علامة مختلفة في المراحل المختلفة لتقسيم الخلية. هذا يعزز إلى حد كبير من تطبيق وبراعة الأسلوب. يمكن استخدام هذا البروتوكول في أبحاث السرطان وفي أي نوع آخر من الأمراض حيث توجد حاجة لتحديد أنماط تعبير بروتينية محددة لدورة الخلايا.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى أنواع الخلايا الأخرى، وفي الكائنات الأخرى النموذجية. يجب أن تركز المرة الأولى للمستخدم على الحصول على أفضل نوعية إعداد الخلية ممكن. وهذا يتطلب معالجة في الوقت المناسب من الجلد التجريبي باستخدام الكواشف الطازجة، والحد الأدنى من الوقت هضم الأنسجة، والتخلص بعناية من المغرور بعد الطرد المركزي للحفاظ على سلامة وكمية الخلايا.
للبدء، تصميم لوحة الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن باستخدام برنامج تصميم لوحة مجانية عبر الإنترنت، كما هو موضح في المخطوطة. ثم قم بإعداد محلول مخزون IDU عن طريق حل مسحوق IDU عند 10 ملليغرام لكل ملليلتر في 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي عند 60 درجة مئوية. بعد aliquoting حل الأسهم IdU في أنابيب microcentrifuge، تجميدها في ناقص 20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
قبل الاستخدام مباشرة، ضبط الرقم الH من محلول ادييو إلى 7.5 مع 12 حمض الهيدروكلوريك العادي، واختبار مع شريط الرقم الH على aliquot النبذ لضمان الحل هو في الرقم الH 7.5. لإعداد اثنين من حل إصلاح paraformaldehyde x ، والجمع بين خمسة ملليلتر من 10 × برنامج تلفزيوني ومليلتر واحد من 16 ٪ PFA مع 44 ملليلتر من نقية الجزيئية الصف المقطر المياه. لإعداد 100 مللولير سيسبلاتين الأسهم حل, حل 300.5 ملليغرام من مسحوق سيسبلاتين في 10 ملليلتر من DMSO.
للتجارب التي سيتم استخدامها على مدى يوم واحد، وإعداد 10 ملللار سيسبلاتين حل العمل. وزن الفئران ومن ثم تحديد جرعة في 0.1 ملليغرام من IdU لكل غرام من وزن الجسم. إدارة الجرعة المحسوبة من IDU عن طريق حقن داخل الصفاق، وانتظر لمدة ساعتين قبل حصاد الخلايا.
استخدم زوجًا من مقصات الصف الجراحي لإزالة أذن الماوس المُسَنََّن سابقًا في قاعدة الأذن جراحيًا. ضع الأذن على طبق بيتري جاف 100 ملليمتر. فصل بعناية الأمامي من الجلد الخلفي باستخدام الملقط غرامة لخلق جيب في منتصف أو حافة منطقة قطع، ثم سحب اللوحات الجلد اثنين بعيدا، والمضي قدما مع كل من الأمامي والخلفي جلود.
ضع بعناية الجلود الأمامية والخلفية لأذن واحدة في بئر واحد من لوحة ثقافة 12 بئرًا ، مليئة بميليلتر واحد من محلول dispase/collagenase الطازج ، مع جانب الجلد من الجلد الذي يلمس الحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم الجلد. ضع الأذن المهضمة أو جلد الوليد في طبق بيتري نظيف مع جانب البشرة لمس سطح الطبق.
باستخدام ملقط، تسطيح الجلد وشريحة بلطف الأدمة قبالة البشرة من خلال العمل من المركز إلى الحواف في نمط دائري. مع ملقط، والاستيلاء على البشرة على حواف ورفع بلطف تشغيله عن طريق تقشير تشغيله قبالة سطح طبق بيتري. ضع البشرة بعناية على محلول انفصال الخلايا المدفأة في بئر واحد من الطبق.
احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية أو 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ملقط العقيمة لفهم البشرة وفرك عن طريق سحب البشرة ضد الجزء السفلي من الطبق لتفكك الخلايا. إضافة ملليلتر واحد من DMEM تحتوي على 1٪ FBS، وتمرير من خلال منخل خلية ميكرومتر 40 في أنبوب جمع.
شطف جيدا مع اثنين من المليلتر إضافية من DMEM وإضافة إلى تعليق الخلية. بعد الطرد المركزي في 120 مرات ز لمدة خمس دقائق، وpirate بعناية عظمى. Resuspend بيليه الخلية في 1-2 ملليلتر من DMEM تحتوي على 1٪ FBS، و بيليه الخلايا مرة أخرى كما كان سابقا.
لتسمية الخلايا لتحديد الخلايا الحية والميتة، resuspend 1-3000000 خلية في ملليلتر واحد من DMEM تحتوي على 25 سيسبلاتين ميكرومولار واحتضان لمدة دقيقة واحدة. إخماد بواسطة الأنابيب مع حجم متساو من FBS. بعد الطرد المركزي في 120 مرة ز لمدة خمس دقائق، decant supernatant في الكأس التي تحتوي على التبييض المخفف، وعكس الأنابيب لاستنزاف الحل المتبقي على منشفة ورقية.
إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلترين من برنامج تلفزيوني خالية من الكاتيوم، والطرد المركزي لهم مرة أخرى كما وصف سابقا. لإصلاح الخلايا، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني خالية من الكاتيون. دوامة الخلايا تحت الطاقة المنخفضة المستمر وإضافة ملليلتر واحد من اثنين x PFA تثبيت العازلة قطرة من الحكمة.
ضعه على منصة هزازة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، بعناية طاردة من زان. غسل الخلايا مع مليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني خالية من الكاتيوم، والطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف، وتكرار خطوة الغسيل.
وأخيرا ، resuspend بيليه في ملليلتر اثنين من الباريوم خالية من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق وdedeant بعناية فائقة. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من واحد x تثبيت العازلة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة وتكرار الطرد المركزي.
لغسل الخلايا، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للباركود. أثناء الطرد المركزي للخلايا بمعدل 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، قم بإعداد الباركود بإضافة 100 ميكرولترات من عازلة الباركود الباركود، واخلطها على الفور. Resuspend بيليه الخلية في 800 microliters من العازلة permeabilization الباركود.
إضافة حل الباركود إلى الخلايا، مزيج، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. غسل الخلايا في مليلتر من خلية تلطيخ العازلة والطرد المركزي مرة أخرى.
المقبل، resuspend واحد إلى ثلاثة ملايين خلية في ملليلتر واحد من مستضد نووي تلطيخ حل العمل العازلة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، بعناية طاردة من زان. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المستضد النووي تلطيخ عازلة permeabilization والطرد المركزي مرة أخرى.
بعد تكرار إعادة التبجح والطرد المركزي، إعادة تعليق بيليه الخلية في وحدة التخزين المتبقية مع دوامة لطيف. أضف 50 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا، واخلطها، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. إضافة ملليلترين من خلية تلطيخ العازلة.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف كما في الخطوة السابقة، وإزالة الفائق. إعادة تعليق بيليه في مليلترين من خلية تلطيخ العازلة، والطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، وتكرار إعادة تعليق والطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول التشابك، وتخزينها لمدة يوم إلى ثلاثة أيام في أربع درجات مئوية.
بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، وغسل بيليه مع مليلتر اثنين من خلية تلطيخ العازلة، والطرد المركزي في ظل نفس الظروف، وإجراء اثنين من يغسل إضافية مع اثنين ملليلتر من الماء، مع نفس الطرد المركزي. Resuspend بيليه الخلية بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر مع محلول خرز EQ المخفف ، ثم قم بتشغيل العينات على مقياس الخلايا الكتلي. يتم تحديد إنتاجية الخلايا المتوقعة و قابليتها للبقاء من أذن الماوس البالغة و جلد الوليد.
يعتمد العائد التقريبي على مساحة الجلد. تعتبر بشرة الولدان اختيارًا أفضل للتجارب التي تتطلب أعدادًا أكبر من الخلايا. يتم عرض استراتيجية البوابات الأساسية لتحديد الخلايا السليمة والوازية والقابلة للحياة ، بعد التطبيع وdevolution بيانات قياس الخلايا الكتلية المك الشريطية.
قد تكون النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة مؤشراً على نوعية الخلايا أو حالتها قبل تلطيخها. تظهر أيضًا الاختلافات في قابلية البقاء بين خلايا سرطانية مُزَدَّمة مقابل خلايا الأذن الماوس المعزولة. تم اِسَرَد الخلايا القابلة للحياة على طول الحدث مقابل CD45 لاستبعاد خلايا الدم.
إدراج علامات النسب يسمح لاختيار مجموعات الخلايا ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة. يتم الحصول على التشكيل الجانبي لدورة الخلية الأساسية عن طريق الكشف عن BrdU مقابل PI في عملية استئصال الخلايا القائمة على الفلورسنت. ومع ذلك، فإن إدراج علامات الانتشار الأخرى ذات القياس الخلوي الكتلي، يسمح بتحديد أكثر دقة لمراحل دورة الخلية.
باتباع هذا النهج، يمكن إنشاء ملفات تعريف دورة الخلية لأنواع الخلايا المختلفة أو الظروف التجريبية، مثل ملفات تعريف لـ CD45 سالب مقابل الخلايا الإيجابية CD45 من نفس التجربة. وفي مثال آخر، كشف تحليل العلامات التي تحدد مسارات إشارات EGFR وmTOR PI3K في مرحلة G-One، عن ملامح تعبيرية مماثلة في الخلايا السلبية CD45، كما تظهر في الخلايا الإيجابية CD45، الموضحة باللون الأزرق. يتطلب استئصال الخلايا الشامل الكثير من الخلايا عالية الجودة.
إذا كان المستخدم مهتماً بـ مجموعة خلايا نادرة، قد تكون هناك حاجة إلى أعداد أكبر من الخلايا. يمكن استخدام الخلايا الحية المعزولة لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، والدراسات الكيميائية الحيوية ، أو يمكن استخدامها في زراعة الأنسجة قبل التثبيت والتلطخ للخلايا الكتلة. يجب على المستخدم استخدام معدات الحماية الشخصية ومجلس الوزراء السلامة عند الضرورة، عند العمل مع paraformaldehyde، حمض الهيدروكلوريك، أو هيدروكسيد الصوديوم.
