このプロトコルは、主に 2 つの理由から重要です。第1に、動物モデルから単離された皮膚細胞の細胞周期状態をユーザが決定することができる。また、細胞周期の離散段階でタンパク質発現を分析することもできます。
細胞増殖を決定する従来の方法と比較して、我々の方法は、細胞周期における異なる相のより正確な決定を可能にし、また、細胞分裂の様々な段階で40以上の異なるマーカーを分析することができます。これにより、この方法の用途と汎用性が大幅に向上します。このプロトコルは、癌研究や細胞周期特異的なタンパク質発現パターンを決定する必要がある他のタイプの疾患で使用することができます。
さらに、このプロトコルは、他の細胞タイプ、および他のモデル生物に変更することができる。初めてユーザーは、可能な限り最高品質の細胞の準備を得ることに焦点を当てる必要があります。そのためには、新鮮な試薬を用いた実験用皮膚のタイムリーな処理、組織消化時間の最小化、遠心分離後の上清の慎重な廃棄が必要であり、細胞の完全性と量を維持します。
まず、原稿に記載されているように、無料のオンラインパネル設計ソフトウェアを使用して金属タグ付き抗体パネルを設計します。その後、60°Cで0.1通常の水酸化ナトリウムで1ミリリットルあたり10ミリグラムでIdU粉末を溶解することによってIdUストック溶液を調製します。IdUストック溶液をマイクロ遠心チューブにアリクォートした後、長期保存のためにマイナス20°Cで凍結します。
使用直前に、12の通常の塩酸でIdU溶液のpHを7.5に調整し、廃棄アリコート上のpHストリップでテストして溶液がpH 7.5であることを確認します。2つのxパラホルムアルデヒド固定溶液を調製するには、10 x PBSの5ミリリットルと16%PFAの1ミリリットルを44ミリリットルの純粋な分子グレード蒸留水と組み合わせます。100ミリモルシプラチンストック溶液を調製するには、300.5ミリグラムのシスプラチン粉末を10ミリリットルのDMSOに溶解する。
1日にわたって使用する実験のために、10ミリモルのシスプラチン作業溶液を調製する。マウスの重量を量り、体重1グラム当たりIdUの0.1ミリグラムで用量を決定する。腹腔内注射によりIDUの計算用量を投与し、細胞を収穫する前に2時間待つ。
外科グレードのはさみを使用して、以前に耳の基部にIdUを注射した安楽死させたマウスの耳を外科的に取り除きます。乾いた100ミリメートルのペトリ皿に耳を置きます。細かい鉗子を使って後部皮膚から前部を慎重に分離し、カット領域の中央または端にポケットを作成し、2つの皮膚フラップを引き離し、前部および後部の両方の皮膚を引き出します。
12ウェルの培養プレートの1つの井戸に1つの耳の前部および後部の皮を慎重に置き、1ミリリットルの新鮮なディスパーゼ/コラゲナーゼ溶液を充填し、皮膚の皮膚側が溶液に触れる。皮を消化するために1時間摂氏37度でインキュベート。消化した耳または新生児の皮膚を、表皮側が皿の表面に触れたきれいなペトリ皿に入れます。
鉗子を使用して、皮膚を平らにし、円形のパターンで中央から端まで働くことによって表皮から真皮を穏やかにスライドさせます。鉗子で、端の表皮をつかみ、ペトリ皿の表面から剥がすことによって穏やかにそれを持ち上げます。慎重にプレートの1つのウェルに温め前の細胞剥離液の上に表皮を置きます。
摂氏37度で5分間、室温で20分インキュベートします。滅菌鉗子を使用して表皮をつかみ、表皮を皿の底に引きずり込んで細胞を解負します。1%FBSを含むDMEMを1ミリリットル加え、40マイクロメートルのセルふるいを通して回収管に入れる。
DMEMの追加の2ミリリットルでよくすすい、細胞の懸濁液に加えます。120回gで5分間遠心した後、上清を慎重に吸引する。1%FBSを含むDMEMの1〜2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、細胞を以前のように再度ペレットする。
細胞にラベルを付けて生細胞と死細胞を決定するには、25個のミクロモルシスプラチンを含むDMEMの1ミリリットルに1〜300万個の細胞を再懸濁し、1分間インキュベートする。同じ量のFBSでピペットを入れる。120回gで5分間遠心した後、上澄み液を希釈した漂白剤を含むビーカーにデカントし、チューブを反転させて残りの溶液をペーパータオルに排出します。
バリウムカチオンフリーPBSの2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、前述のように再び遠心分離する。細胞を固定するには、バリウムカチオンフリーPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。連続低電力下の細胞をボルテックスし、ドロップワイズ2 x PFA固定バッファーの1ミリリットルを追加します。
ロッキングプラットフォーム上に置き、室温で10分間インキュベートします。500回gで5分間遠心した後、上清を慎重にデカントする。バリウムカチオンフリーPBSの2ミリリットルで細胞を洗浄し、同じ条件下で再び遠心分離機を再び、洗浄工程を繰り返します。
最後に、2ミリリットルのバリウムカチオンフリーPBSでペレットを再懸濁する。500回gで5分間遠心分離し、上清を慎重にデカントする。1つのx固定バッファーの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、室温で10分間インキュベートし、遠心分離を繰り返します。
細胞を洗浄するには、1ミリリットルのバーコードパーメアビライゼーションバッファーを追加します。5分間gの500倍で細胞遠心処理の間、100マイクロリットルのバーコード透過バッファーを添加してバーコードを調製し、すぐに混ぜます。800マイクロリットルのバーコード透過バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。
細胞にバーコード溶液を加え、混合し、室温で30分間インキュベートします。5分間500回gで遠心分離機。細胞染色バッファーと遠心分離機の 2 ミリリットルで細胞を再び洗浄します。.
次に、核抗原染色緩衝液の1ミリリットルに1〜300万個の細胞を再懸濁し、室温で30分間インキュベートする。500回gで5分間遠心した後、上清を慎重にデカントする。再び1ミリリットルの核抗原染色透過バッファーおよび遠心分離機で細胞を再懸濁する。
再懸濁と遠心分離を繰り返した後、残留体積中の細胞ペレットを穏やかな渦で再懸濁する。50マイクロリットルの細胞内抗体カクテルを加え、混合し、室温で45分間インキュベートします。細胞染色バッファーを 2 ミリリットル追加します。.
前工程と同じ条件で遠心分離機を再度、上清を除去する。ペレットを2ミリリットルの細胞染色バッファーに再懸濁し、遠心分離機を500回gで5分間再懸濁し、再懸濁および遠心分離を繰り返す。インターカレーション溶液の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、摂氏4度で1〜3日間保存します。
再び細胞を遠心分離した後、ペレットを2ミリリットルの細胞染色バッファーで洗浄し、同じ条件で遠心分離し、同じ遠心分離で2ミリリットルの水で2回の追加洗浄を行います。希釈されたEQビーズ溶液で1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で細胞ペレットを再懸濁し、次いで質量細胞量計でサンプルを実行します。成人マウス耳および新生児皮膚からの期待細胞収率および生存率が決定される。
おおよその収率は、皮膚の表面積に依存します。新生児の皮膚は、より多くの細胞を必要とする実験のためのより良い選択です。バーコード質量サイトメトリーデータの正規化およびデコンボリューション後に、無傷、単一、生存可能な細胞を選択する基本的な格言戦略が示されている。
生存可能な細胞の割合は、染色前の細胞の品質または状態を示すものであってもよい。培養癌細胞と単離されたマウスの耳細胞との間の生存率の違いも示されている。生存可能な細胞は、造血細胞を除外するためにCD45と対比してイベント長にゲート付けされた。
系統マーカーを含めることによって、異なる細胞周期段階で目的とする細胞集団を選択することができます。基本的な細胞周期プロファイルは、蛍光ベースのフローサイトメトリーにおけるBrdU対PIの検出によって得られる。しかし、他の増殖マーカーを質量サイトメトリーと組み込んで、細胞周期相をより正確に同定することが可能である。
このアプローチに従って、細胞周期プロファイルは、同じ実験のCD45陰性細胞とCD45陽性細胞のプロファイルなど、異なる細胞タイプまたは実験条件に対して構築することができる。別の例では、G−1相におけるEGFRおよびmTOR PI3Kシグナル伝達経路を定義するマーカーの分析は、青色で示されるオレンジ、およびCD45陽性細胞とのCD45陰性細胞における類似の発現プロファイルを明らかにした。質量細胞測定は、高品質の細胞の多くを必要とします。
ユーザーが希少な細胞集団に関心を持っている場合は、より多くの細胞が必要になる場合があります。分離された生きた細胞は、DNAまたはRNA分析、生化学的研究、または固化前の組織培養で使用することができ、質量サイトメトリーのために染色する。パラホルムアルデヒド、塩酸、または水酸化ナトリウムを使用する場合は、必要に応じて個人保護装置と安全キャビネットを使用する必要があります。
