在该协议中，我们可以识别蛋白质和DNA之间的相互作用，揭示基因的转录调控。这有助于理解细胞中的分子机制。我们修改预先存在的协议，然后建立一个简单明了的检测协议。
您只需按照第一步的协议进行，即可成功完成测定。为了准备交联染色质，在烟罩中，将四毫升1%VCaP细胞培养基和0.229毫升18.5%PFA的0.229毫升添加到6厘米的培养皿中。轻轻旋转盘，均匀分布 PFA。
在室温下孵育整整10分钟。然后，在菜中加入0.47毫升1.25摩尔甘油溶液，并在室温下孵育5分钟，停止进一步的交联。根据手稿清洗细胞后，刮取细胞，将细胞悬浮液转移到1.5毫升微离心管。
在室温下将带细胞悬浮液的管子在3000次g下离心5分钟，以回收细胞颗粒。使用移液器完全拆下 PBS。记录每个管的细胞数，并在零下80摄氏度储存细胞颗粒。
要进行细胞解解，首先在冰上解冻储存的VCAP细胞颗粒。将 300 微升的已准备好的 ChIP 细胞解液缓冲液添加到每个管中，并辅以 PIC，并彻底重新填充颗粒。旋转管15秒，在冰上孵化悬浮液10分钟。
在摄氏4度下以9000倍的温度下离心，3分钟。完全去除上流剂，并加入300微升的MNase消化缓冲液，以重新暂停颗粒。在1.5毫升管中用MNase消化缓冲液稀释MNase，每微升产生50个凝胶单位。
将稀释的MNase加入悬浮液中，在37摄氏度下孵育10分钟。每 2 1~2 分钟通过反转设置混合。为了终止MNase消化，在pH8处加入30微升0.5摩尔EDTA，并短暂加入涡流。
在冰上孵育5分钟后，在摄氏4度下以9000次g离心，5分钟。完全去除上流液，将颗粒重新在 300 微升的已准备的 ChIP 稀释缓冲液中，并辅以 PIC。然后，在配备微提示探头的声波器上，将声波条件设置为振幅2，处理时间15秒，脉冲开5秒，脉冲关闭30秒。
在冰上对悬浮液进行声波化。绘制悬架的一微升，并点到滑动玻璃上。在显微镜下，观察以确保细胞结构几乎被打破。
在4摄氏度下以9000倍g离心管10分钟，然后将上流水线转移到新的1.5毫升微离心管中。将消化的染色质的20微升保存在1.5毫升的螺丝管中，用于进一步治疗，并在零下80摄氏度下储存其余。首先，在每个1.5毫升的螺杆管中，加入75微升水、4微升五摩尔氯化钠和1微升蛋白酶K.To去除蛋白质和DNA之间的交联，将20微升的消化铬素从每个MNase消化条件添加到螺杆管中。
紧闭盖子，完全混合，并在65摄氏度过夜孵育管。早晨，在将管子离心2到3000次g后，加入100微升PCI。大力旋转，形成乳液。
在室温下，以最高速度再次离心管 30 秒。然后，准备两个1.5毫升的微离心管每个条件。在一个管中加入100微升PCI。
在pH 5.2下加入10微升三摩尔醋酸钠，将两微升糖原加入另一根管中。从从离心机中取出的管子中，小心地绘制含有DNA的上相，并将其添加到含有PCI的管中。大力旋转，并在室温下以最高速度离心管30秒。
接下来，将上相转移到含有醋酸钠和糖原的管中。加入250微升乙醇，通过倒置混合。在室温下孵育10分钟。
在4摄氏度下以最高速度将管子离心30分钟。确认管底的颗粒。小心地去除上一液，以免干扰颗粒，并加入500微升70%乙醇。
在4摄氏度下以最高速度将管子离心5分钟。完全取出上一液，在室温下干燥颗粒约五分钟。然后，加入20微升TE溶解颗粒。
使用紫外分光光度计测量DNA浓度。制备消化的染色质后，将所有样品解冻在冰上。加入1200微升的已准备的ChIP稀释缓冲液，辅以PIC稀释消化的染色质，浓度为每500微升5微克。
将稀释的消化染色质的五微升加入 1.5 毫升的螺杆管作为输入样品。样品储存在零下80摄氏度。将稀释后的染色质每层加入500微升，加入1.5毫升的螺杆，作为免疫沉淀样品。
在每个管中加入两微克抗体，然后关闭瓶盖。在四摄氏度下孵育管子，在摇台上轻轻混合。早晨，在每个管中加入30微升ChIP级蛋白G磁珠。
在四摄氏度下再次孵育管子，用温和的混合孵育两个小时。之后，以2至3000倍g的短暂速度将管子旋转，将管放在含有镉磁铁的聚乙烯机架中一分钟。然后，小心地通过吸气去除上一杯。
接下来，在每个管中加入0.5毫升的低盐免疫复合洗涤缓冲液。短暂地旋转管子以分散珠子。在四摄氏度下孵育管子五分钟，在摇台上轻轻混合。
根据手稿，使用高盐免疫复合物和氯化锂免疫复合物重复洗涤。完全去除剩余的上流液后，向管中加入150微升洗脱缓冲液。旋转管完全分散珠子。
关闭盖子，在65摄氏度下孵育管子30分钟。要彻底分散珠子，每五分钟进行一次反转混合。在孵育过程中，准备一个1.5毫升的螺丝管，并加入6微升的五摩尔氯化钠和2微升的蛋白酶K.Thaw以前在冰上制备的1%输入样品。
在输入样品中加入150微升洗脱缓冲液、6微升五摩尔氯化钠和2微升蛋白酶K。孵育含有珠子的管子后，旋转下来。将管放在磁架中一分钟，将上清液转移到含有氯化钠和蛋白酶的螺杆管上。
没有声波，细胞结构保持不变，表明染色质存在于核中。短暂的声波会打破细胞结构。交联染色质由VCaP细胞中产生，并用不同量的MNase进行消化。
在不添加MNase的情况下，出现了分子量非常高的涂片模式。MNase的加入给出了一个阶梯图案，这表明MNase消化了内分体。只有产生高达900 bp的染色质片段的条件才能被认为是适当的消化，而不适当的消化模式显示过度消化，主要导致单核糖体生产。
VCaP细胞中染色质的消化模式表明染色质的消化过程。H3K4甲基基率最高的是AR-TSS上游的0.5千基和1个千基。但是，位于AR-TSS下游19千基和8 kb和12千基的地区，H3K4甲基基3的占用率很小，表明这些区域可以用作负区域。
确定MNase消化条件是最重要的。在每个实验中保持细胞数、缓冲量和酶量。必须为每种单元格类型标识条件。
我们可以对因子和染色质均质捕获的全球占用进行 ChIP 测序，以确定致发基因组病变之间的相互作用。该方法可以揭示转录的过程机制。ChIP 检测是调查转录调控的有力工具，但繁琐且不可重复。
我们的方法鼓励研究人员进行常规和容易的测定。
