小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

计量用于对从小鼠分离的棕色脂质组织中酯蛋白和非酯蛋白进行有效的 ChIP 测序。该技术的主要优点是，该方案已经优化，从脂质组织中对染色质相关复合物进行有效的免疫沉淀。切口前，用70%乙醇喷洒安乐死小鼠。

将鼠标的背部朝上放置，然后沿着颈部进行切口。接下来，将BAT直接放在肩部之间的皮肤下，小心地去除薄薄的白脂肪层。在室温下150 RPM下，将每个 BAT 垫在 10 毫升 PBS 中交叉链接，含有 1% 甲醛 15 分钟。

15分钟后，淬火通过加入2.5摩尔甘氨酸到BAT，最终浓度为125毫摩尔。在摇床上放置五分钟，在室温下以 150 RPM 转速旋转。随后，将BAT垫转移到500微升的低氧解液缓冲液中，并在每个BAT垫上添加两个不锈钢珠。

然后，使用基于珠的组织均质器粉碎组织。以最大功率开始五分钟。如果需要，延长时间，直到组织均质和单细胞分离。

将样品转移到新管中，在16，000G的4摄氏度下离心10分钟。10分钟后，将上经剂转移到新管中，将细胞颗粒留在冰上。在16000摄氏度下将上一代离心10分钟，以防止浮细胞丢失。

然后，将最终的上流液和重新悬浮在300微升SDS解液缓冲液中，再使用1次蛋白酶抑制剂。在冰上孵育10分钟。接下来，对裂酸进行声波化，生成200至500个碱基对。

声波化后，在摄氏4度的16，000G下，通过离心清除碎屑10分钟。要进行免疫沉淀，请将 1% 的染色质溶液放在 ChIP 输入之外，并在 4 摄氏度下隔夜保持输入。接下来，将ChIP抗体加入一毫升的染色质溶液中，并执行平行免疫沉淀与相应的免疫前IgG或同一物种的正常IgG。

或者，保存一毫升的染色质溶液，以进行无抗体控制。在四摄氏度下孵育，旋转。为了收集免疫复合物，在免疫复合物中加入50微升的蛋白质 A a agarose 50%泥浆，并在4摄氏度下孵育1小时，在150 RPM下旋转。

一小时后，在4摄氏度下，在1000次G下，通过离心将珠子分粒1分钟。在0.45微米PVDF离心滤芯柱上对珠子进行顺序清洗，通过先用500微升低盐洗涤缓冲液转移柱中的珠子，增加细度。然后，在2500G下将珠子在柱子中分粒三分钟。

根据低盐洗涤程序，使用高盐洗涤液重复洗涤。然后，使用氯化锂重复该过程，最后使用一次 TE。洗涤完成后，通过向柱中的颗粒珠中加入300微升洗脱缓冲液来洗脱免疫复合物。在室温下以 400 RPM 的摇床孵育 30 分钟。

随后，在 2500 G 的新鲜管中旋转柱子三分钟，收集水。通过孵化在65摄氏度下收集的精灵和输入来反转交叉环节。为了恢复DNA，将300微升苯酚氯仿 IAA 加入到 elute 中，以一对一的比例输入，并在涡流中输入 10 秒。

接下来，在摄氏4度的21，000G下旋转20分钟。保留颗粒并丢弃上一液。用一毫升的冷70%乙醇清洗颗粒。

然后在摄氏4度的21，000G下旋转5分钟。丢弃上一液，空气干燥颗粒。将颗粒重新悬浮在 70 微升无 DNAse 水中，以进行进一步操作。

下面是使用从野生型或 GPS2-A 敲除小鼠分离的 BAT 的 ChIP Q PCR 示例。由于发现GPS2需要在不同的细胞系中表达核编码线粒体基因，因此在两个特定的核编码线粒体基因上测试了GPS2的招募。NDUFV1 和 TOMM20 在 BAT 中来自小鼠，作为线粒体中高度丰富的组织的示例。

GPS2启动子占用率比较在GPS2-A淘汰小鼠和野生类型字母伴侣。GPS2对BAT中选择性目标基因的结合预期减少，来自GPS2-A敲击小鼠。使用此处描述的协议，与野生类型字母配合相比，GPS2-A 敲除小鼠在 BAT 中记录了RNA聚合酶二和压抑组蛋白标记 H3K9ME3 的增强结合。

这些结果证实了在选定的核编码线粒体基因上招募GPS2，并表明需要GPS2来防止H3K9ME3的积累，因此需要阻止目标启动器上二极的转录活动。此处描述的协议，即使针对棕色脂肪组织进行了专门优化，也代表了从其他粘结和人体组织中执行 ChIP 的重要工具。不要忘记，使用苯氯仿工作可能极其危险。

因此，在使用这种试剂时始终在烟罩下操作非常重要。