该协议很重要，因为它显示了高分辨率染色体环和其他短程相互作用特征。该技术的主要优点是具有核小体分辨率和高信噪比的 3D 基因组组织图谱。为了进行MNase滴定，在冰上解冻10倍于第六个细胞的沉淀10分钟，并将细胞重悬于500微升DPBS中，并将细胞悬浮液在冰上孵育20分钟。
通过在室温下以10,000G离心5分钟来收集细胞，并除去上清液。将沉淀的细胞重悬于500微升MB Number 1缓冲液中。解冻一小瓶每微升 MNase 20 单位，并用 10 毫摩尔 Tris 稀释，以适应文中描述的消化条件。
以 10 至 20 秒的适当时间间隔，将一微升第一种 MNase 消化溶液加入四个样品管之一中，涡旋并在 37 摄氏度的 ThermoMixer 中以 800 RPM 孵育 10 分钟。继续从剩余的MNase稀释液中加入1μL到其他细胞等分试样中。通过以相同的顺序和添加MNase的相同时间间隔向每个试管中加入200微升新鲜制备的终止缓冲液来终止MNase消化。
在 65 摄氏度下孵育两小时。向每个样品中加入 500 微升 PCI，并通过涡旋充分混合。在室温下以 19， 800 G 离心 5 分钟以分离相。
并将水相转移到新管中。根据制造商的说明，使用商业 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA，并在 12 μL 洗脱缓冲液中洗脱样品。向纯化的 DNA 样品中加入 2 至 5 微升上样染料。
在1.5%琼脂糖凝胶上运行样品，并为实验选择最佳消化度。最佳消化度显示几乎无亚核小体片段，单核小体与二核小体比例为 70% 至 90%。在这个具有代表性的样品中，选择泳道3和泳道4之间的中间消化度进行后续实验。
基于MNase滴定，通过向每个样品等分试样中加入适量的MNase来消化染色质。充分混合并在 ThermoMixer 中以 37 摄氏度、800 RPM 的速度孵育 10 分钟。通过向每个等分试样中加入 1.6 微升 0.5 摩尔 EGTA 来停止 MNase 消化，并在 65 摄氏度的 ThermoMixer 中以 800 RPM 振荡孵育 10 分钟。
通过在室温下以10,000G离心5分钟收集样品，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 500 微升 1X NEB 缓冲液 2.1 中。将相当于输入的 5 乘以 10 到第六个单元格或更少的样本池合并以进行进一步处理。
在进行邻位连接之前，转移 10% 的样品作为输入对照以监测 MNase 消化水平。向消化对照中加入 150 微升 10 毫摩尔 Tris、25 微升 10%SDS 和 25 微升 20 毫克/毫升蛋白酶 K，并在 65 摄氏度下孵育过夜。通过在4摄氏度下以10,000G离心5分钟来收集剩余的样品，并弃去上清液。
将沉淀重悬于90微升新鲜制备的Micro-C预混液中，并在37摄氏度，800转/分的热混合器中孵育15分钟。加入 10 微升每微升 5 个单位的 Klenow 片段，并在 ThermoMixer 中孵育。然后加入 100 微升新鲜制备的 Micro-C 预混液两种。
在 25 摄氏度、800 RPM 下孵育 45 分钟，并按照文中所述淬灭与 EDTA 的酶促反应。在 65 摄氏度、800 RPM 的热混合器中孵育 20 分钟。通过在4摄氏度下以10,000G离心5分钟收集样品，并弃去上清液。
将样品重悬于 500 微升新鲜制备的 Micro-C 预混液 3 中，并在室温下以 15 至 20 RPM 孵育 2.5 小时。重复离心并除去上清液。然后将样品重悬于 200 微升新鲜制备的 Micro-C 预混液 4 中，并在 37 摄氏度的 ThermoMixer 中以 800 RPM 孵育 15 分钟。
对于反向交联和脱蛋白，向样品中加入 25 微升每微升 20 毫克蛋白酶 K 和 25 微升 10%SDS，并在 65 摄氏度下间歇混合孵育过夜。向样品和输入对照中加入 500 微升 PCI，然后通过涡旋混合。通过在19,800G离心5分钟来分离相，并将上层水相转移到新管中。
浓缩 DNA 并在 30 微升中洗脱样品，并在 15 微升中洗脱输入对照。运行 1.5% 琼脂糖凝胶以分离单核小体和二核小体。切除具有二核粒大小的 DNA 片段，并按照文本中的描述提取 DNA。
将 150 微升预制珠子加入 150 微升样品中，并在室温下孵育。将试管放入适当的磁铁中，等待溶液清除。除去上清液，将珠子重悬于300微升1X TBW中，然后重复此步骤。
重复磁性分离，溶液澄清后，除去上清液，将珠子重悬于100微升0.1X TE中。重复并重悬于 50 微升 0.1X TE 中。将溶液转移到PCR管中，并按照文中所述进行DNA操作。接头连接完成后，在 1X TBW 中洗涤样品，弃去上清液并将珠子重悬于 20 μL 的 0.1X TE 中。优化PCR循环次数并扩增序列文库，如文中所述。每个反应中 250， 000 个细胞的染色质用 MNase 的四倍稀释液消化。
最高浓度（10 个单位）显示过度消化的染色质几乎完全由单核小体 DNA 组成。用 0.625 单位 MNase 消化 250， 000 个小鼠 ES 细胞，为 Micro-C 实验中的制备性消化提供了最有希望的起点。然而，应考虑泳道 3 和 4 所示条件之间的中间 MNase 浓度，相当于每 100 万个细胞 5 个单位。
邻近连接的单核小体条带的大小约为 300 个碱基对，与二核小体相似。因此，单核小体与二核小体的带信号比从以单核小体为主向二核小体转变。通过最小的PCR评估制备的测序文库的质量和数量。
可视化显示 420 个碱基对处有一个不同的条带，并且没有衔接子二聚体的条带。虽然本研究中的两个样本都显示出较高的映射率，但良好样本的顺式读长比例更高。高跨染色体相互作用率表明随机连接事件，尽管一些跨染色体相互作用可能很重要。
此外，良好样本具有中等速率的正向-反向映射读取对，距离小于 500 个碱基对。这表明未被MNase切割的二核小体的发生率较低，其大小与两个邻近连接的核小体相似。适当的MNase消化度对于该实验至关重要。
过度消化的核小体连接效率低下，消化不足的染色质有很大一部分未消化的二核小体会污染测序文库。Micro-C 可以与捕获方法相结合，以极高的分辨率绘制基因座特异性基因组组织图。
