使用单卵母细胞记者测定在体外成熟期间的母体 mRNA 翻译程序

此方法可用于识别和描述控制卵母细胞成熟期间翻译的调节元素。我们应用延时显微镜来评估记者在整个体外卵母细胞成熟过程中的积累。这准确地指出了在卵母细胞成熟期间发生转化激活或压抑的时间。

首先，用26根针在毛囊壁上做一个小切口，小心地打开心角囊。使用口腔操作的玻璃移液器，将几层积积细胞分离出完整的 COC。使用较小的移液器，并通过重复管道机械地去污 COC。

吸气的卵母细胞，并把它们放在一个培养皿与成熟介质补充一微摩尔的西洛斯塔米德。将菜放在孵化器中两小时，让卵母细胞从卵泡分离所引起的压力中恢复过来。将一根10厘米长的薄氧玻璃毛细管放在机械拉杆中，准备注射针头。

使用加热灯丝以 45 度角弯曲针尖，以获得最佳注射效果。将20个基本卵母细胞收集介质的微滑液滴放在聚苯乙烯盘中，用轻质矿物油覆盖液滴。通过每微升 Ypet UTR 和 mCherry 各添加 12.5 微克，准备更大的记者组合。

在零下80摄氏度下储存这些阿里报价。解冻后，以2万倍G将离心机切入两分钟，然后将其转移到新的微中转管。用大约0.5微升的记者混合加载注射针。

将握管和注射针放入支架中，并将其放置在卵母细胞收集介质的液滴中。轻轻敲击注射针，使其贴在握住的移液器上，打开注射针。将卵母细胞放在基本收集介质的液滴中，并注射5到10个记者混合的皮质。

用一种微摩尔西洛酰胺孵化卵母细胞和成熟介质16小时，使mCherry信号稳定下来。对于延时显微镜，为每个注射的记者准备一个培养皿，每个注射的记者有两个20微升的成熟介质滴，一个液滴与一个微摩尔西洛酰胺用于控制前兆I-逮捕的卵母细胞，一个没有西洛酰胺的液滴用于成熟的卵母细胞。用轻质矿物油盖住水滴，并将其放置在孵化器中。

预孵化后，从孵化器中取出注射的卵母细胞，并在成熟介质中清洗四次，无氯酰胺。将一些卵母细胞保持在成熟介质中，其中一微摩尔西洛酰胺作为第一阶段卵母细胞控制组。将注射的卵母细胞转移到先前准备的延时显微镜盘上各自的液滴中。

用封闭的玻璃移液器将卵母细胞聚集在一起，以防止它们在录制过程中移动。使用文本手稿中提到的参数，将盘子放在显微镜下，配备发光二极管消除系统和配备环境室的电动舞台，该室维护在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳中。通过单击应用，然后进行多维采集，输入延时实验的相应设置。

选择第一个选项卡主选项卡，并选择延时、多个阶段位置和多个波长。选择"保存"选项卡以输入应保存实验的位置。然后选择选项卡延时输入时间点、持续时间和时间间隔数。

选择禁忌阶段，打开光明场，并通过打开新窗口并选择获取、获取和显示实时来定位卵母细胞的位置。一旦卵母细胞被定位，切换回多维采集窗口，并按加设置卵母细胞的位置。选择选项卡波长，并为光明场、YFP 和 mCherry 设置三个不同的波长。

调整 Ypet 和 mCherry 的曝光率，然后点击获取开始延时实验。为了分析Ypet三个主要的UTR翻译，执行两个区域测量每个卵母细胞，卵母细胞本身点击椭圆区域，和一个小区域周围的卵母细胞用于背景减法点击矩形区域。通过单击"打开日志"然后"日志数据"将区域测量数据导出到电子表格中。

对于每个单独的卵母细胞和所有测量的时间点，从卵母细胞区域测量中分别减去YFP和mCherry波长的背景区域测量。在39个卵母细胞中记录了mCherry和YFP在序节I和成熟卵母细胞中的表达，其中30个已经成熟，9个在序言I中作为负控制被捕。通过将YFP信号除以前10个时间点的平均mCherry信号，将前一阶段I-逮捕和成熟卵母细胞的平均mCherry信号除以，纠正了注射量的单个YFP与mCherry比率。

记者YFP的翻译率是通过曲线测量的YFP与mCherry比率在前一个零至两个小时，或8至10小时后，使用线性回归的西洛酰胺释放。记者的积累不遵循线性模式，如西洛酰胺释放后零至2小时和8至10小时之间的翻译率显著差异，表明卵母细胞肌成熟期间白细胞间7翻译激活。尝试此协议时，请确保在录制开始时曝光时间足够。

请记住，如果在卵母细胞恢复期间激活翻译，信号可能会在时间过程中饱和。使用 YFP 的引金，PCR 可以确认 MRMA 的稳定性。为了确认翻译的变化，您可以使用带有抗体的西文印迹来对抗 V5 技术。